У нас уже 22238 рефератов, курсовых и дипломных работ
Заказать диплом, курсовую, диссертацию


Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Понравилось
Не понравилось





Книга жалоб
и предложений


 






Название Биологические основы совершенствования методов 5орьБ1ы с кровососущими комарами
Количество страниц 169
ВУЗ МГИУ
Год сдачи 2010
Бесплатно Скачать 22934.doc 
Содержание Содержание
ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Общая характеристика работы 4

Глава 1. Современное состояние применения бактериальных

препаратов для борьбы с личинками комаров... 13

1.1. Особенности экологии личинок комаров... 13

1.2. Роль комаров как переносчиков возбудителей болезней на территории России... 17

1.3. Характеристика энтомопатогенных бактерий Bacillus - 20 thuringiensis

1.3.1. Классификация белков Zft... 21

1.3.2. Характеристика белков, синтезируемых штаммами Bt 26

1.3.3. Структура Cry - эндотоксинов... 26

1.3.4. Характеристика Cyt - эндотоксинов... 27

1.3.5. Наличие других токсинов в Bt... 28

1.3.6. Вегетативные инсектицидные белки... 28

1.4. Штаммы В. thuringiensis у активные по отношению к личинкам

комаров... 29

1.4.1. Механизм действия... 31

1.5. Характеристика энтомопатогенных бактерий Bacillus sphaericus 37 1.5.1. Механизм действия кристаллических токсинов Bsph... 40

1.6. Резистентность насекомых к бактериальным препаратам... 43

1.7. Клонирование генов Bt и Bsph... 48

Глава 2. Методика исследований и объем биологического 56

материала ...

Глава 3. Биологическая характеристика энтомопатогенных

видов и штаммов бактерий... 63

3.1. Выделение, характеристика и активность новых штаммов

бактерий... 63

3.1.1 .Bacillus thuringiensis... 63

3

3.1.2. Создание рекомбинантного штамма ... 73

3.1.3. Bacillus sphaericus... 79

3.1.4. Продолжительность ларвицидного действия споро-кристаллических комплексов бактерий Bti и Bsph в лабораторных условиях... 86

3.1.5. Brevibacillus laterosporus... 96

Глава 4. Экспериментальное исследование взаимоотношений

энтомопатогенных бактерий с простейшими водных экосистем 111

4.1. Инсектицидная характеристика энтомопатогенных бактерий

после инкапсуляции их в простейшие... 113

4.1.1. Бактерии Bacillus thuringiensis ssp.israelensis... 113

4.1.2. Бактерии Bacillus sphaericus... 122

4.1.3. Рекомбинантный штамм Methylobacillus flagellatum с клонированным геном синтеза Сгу4В токсического белка Bti... 127

4.1.4. Бактерии Brevibacillus laterosporus... 133

4.2. Продолжительность действия бактерий Bti и Bsph после инкапсуляции их инфузорями Tetrahymena pyriformis... 138

4.2.1. Продолжительность действия смеси Т. pyriformis+ Bti... 140

4.2.2. Продолжительность действия смеси Т. pyriformis-^ Bsph ... 145

4.3. Взаимодействие энтомопатогенных бактерий с простейшими в питательных средах для их культивирования... 147

4.4. Испытание инкапсулированного споро-кристаллического комплекса Bti в Т. pyriformis в полупроизводственных условиях ... 156 Заключение 159 Выводы 164 Практические рекомендации 166 Список литературы 169

Введение



Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Ущерб, наносимый кровососущими насекомыми здоровью людей огромен. Они являются массовыми кровососами, а также переносчиками возбудителей ряда болезней. В настоящее время на Земле около 2 млрд. человек живут в эпидемически опасных зонах, где распространены малярия, желтая лихорадка, лихорадка Денге, энцефалиты и другие трансмиссивные болезни, переносчиками возбудителей которых являются кровососущие комары. Существует около 3000 видов комаров, из которых более 100 являются переносчиками возбудителей болезней человека. В России наибольшее эпидемическое значение имеют комары рода Anopheles, т.к. ситуация в последние годы с заболеваемостью малярией значительно осложнилась. Помимо малярии на территории страны зарегистрированы арбовирусные трансмиссивные лихорадки Карельская, Синдбис и Западного Нила, переносчиками которых являются комары pp. Culex и Aedes (21,24,46).

В настоящее время основным средством борьбы с кровососущими насекомыми остаются химические инсектициды, к которым у насекомых достаточно быстро развивается устойчивость, что требует либо повышения дозировок, либо ротации инсектицидов. Не обладая избирательностью действия, химические инсектициды вызывают гибель не целевых, зачастую полезных организмов. Накопление инсектицидов в природных компонентах (воде, почве и др.) делает их экологически опасными. Указанные недостатки обуславливают необходимость поиска новых экологически безопасных методов борьбы с кровососущими насекомыми. Для борьбы с взрослыми комарами альтернативы химическим препаратам до сих пор нет, однако для уничтожения личинок все шире применяют биологические препараты.

5

Использование бактериальных препаратов против насекомых, имеющих медицинское значение (в первую очередь против комаров и мошек), началось в конце 70 годов XX столетия. Связано это было с открытием бактерий Bacillus thuringiensis ssp. israelensis (Bti). Позднее было показано, что бактерии Bacillus sphaericiis (Bsph) также могут быть использованы в качестве средств борьбы с личинками комаров.

Основным преимуществом биологических препаратов при сравнении с химическими является избирательность действия. Препараты на основе Bti используют на протяжении более 20 лет, и за это время не было зафиксировано ни одного случая их отрицательного воздействия на другие организмы. Не отмечено также возникновения у насекомых устойчивости к этим препаратам. Учитывая способность Bti к синтезу 4 типов белковых токсинов, вряд ли возможно прогнозировать появление устойчивости и в дальнейшем. Несколько иная картина выявляется при использовании препаратов, изготовленных на основе Bsph. Сохраняя высокую избирательность действия, определяемую двумя белками, составляющими бинарный токсин, препараты на основе Bsph при длительном применении в некоторых случаях приводят к появлению резистентных популяций комаров, что было выявлено в Индии, Бразилии, Франции. Тем не менее, отказываться от использования препаратов на основе этой бактерии нецелесообразно, т.к. их перспективность связана с длительным остаточным действием как в водоемах с чистой, так и загрязненной водой. Устойчивость насекомых к препаратам на основе Bsph возможно преодолеть ротацией с ^^-содержащими препаратами и другими ларвицидами.

К недостаткам бактериальных инсектицидов следует отнести относительно непродолжительное остаточное действие. Отсутствие воспроизводства бактерий Bti в природных условиях диктует необходимость повторных обработок водоёмов. Bsph способна воспроизводиться в окружающей среде на погибших личинках комаров, что делает препараты на их основе в ряде случаев более предпочтительными. Однако, следует отметить

6

более узкий спектр инсектицидного действия Bsph, что не позволяет примененять их для борьбы с комарами p. Aedes и вынуждает увеличивать дозировки для воздействия на личинок p. Anopheles.

По экспертным оценкам в дальнейшем доля биологических препаратов для борьбы с кровососущими комарами должна увеличиваться за счет совершенствования препаративных форм, снижения стоимости и разработки рациональной тактики их применения (84, 85, 169, 189, 288). Приведённые соображения подтверждают актуальность проведенных исследований.

Цель и задачи исследования. Поиск и отбор новых активных видов и штаммов энтомопатогенных бактерий и совершенствование биологического метода борьбы с личинками кровососущих комаров. Для достижения поставленной цели потребовалось решить следующие задачи:

• провести отбор новых более эффективных штаммов бактерий Bti и Bsph;

• осуществить поиск бактерий, обладающих ларвицидной активностью, в других таксонономических группах;

• оценить эффективность инсектицидного действия рекомбинатнтного штамма с клонированным геном синтеза ларвицидного токсина;

• выявить факторы, влияющие на сохранение и продолжительность ларвицидного действия Bti и Bsph в водной среде;

• изучить особенности взаимодействия энтомопатогенных бактерий с простейшими в водных экосистемах;

• создать биологическую систему, обеспечивающую длительное сохранение ларвицидных свойств энтомопатогенных бактерий.

Научная новизна результатов исследования. В результате проведенных исследований нами впервые:

• Выявлены и охарактеризованы новые штаммы бактерий Bti и Bsph, эффективность которых превышает известные ранее штаммы.

7

• Создан рекомбинанатный штамм Methylobacillus flagellatum с клонированным геном синтеза Сгу4В токсического белка Bti, эффективный по отношению к личинкам малярийных комаров.

• Выделены 4 кристаллообразующих штамма Brevibacilhis laterosporus, обладающих высокой ларвицидной активностью.

•- Определены факторы, влияющие на сохранение и продолжительность ларвицидного действия Bti и Bsph. Установлена значительная устойчивость споро-кристаллической смеси Bti в водной среде (24 недели).

• Охарактеризованы параметры пролонгирования действия энтомопатогенных бактерий в водной среде. Сроки действия Bti зависят от исходной концентрации споро-кристаллического комплекса и численности личинок комаров.

• Показано, что простейшие Т. pyriformis и Е. .moshkovskii потенциируют основные ларвицидные свойства энтомопатогенных бактерий Bti, Bsph, В. laterosporus и рекомбинантного штамма М. flagellatum (снижение эффективных концентраций и увеличение скорости действия).

• Выявлены различия в характере взаимоотношений простейших с разными видами энтомопатогенных бактерий при длительном контакте.

• Разработана методология создания симбиотической системы Т. pyriformis+ Bti, позволяющая без дополнительного введения бактерий поддерживать их активность на протяжении длительного времени (72 недели срок наблюдений).

Практическая ценность работы. Результаты исследований вносят вклад в решение важной медико-биологической проблемы - контроль численности комаров (переносчиков возбудителей инфекционных болезней) эффективными и экологически безопасными средствами. Значимость работы для практического использования заключается в следующем:

• Получены новые эффективные штаммы бактерий Bti и Bsph, пригодные для промышленного производства.

8

• Выделенные кристаллообразующие штаммы В. laterosporus могут быть использованы в качестве альтернативы биологическим ларвицидам, изготовленным на основе Bti и Bsph.

• Доказана возможность пролонгирования действия при инкапсуляции споро-кристаллического комплекса Bti в инфузории T.pyriformis. Однократное введение этого комплекса в условия изолированных природных водоемов обеспечивает гибель личинок комаров рAnopheles на протяжении сезона потенциальной передачи малярии (10 недель).

• Предложена симбиотическая система «инфузории Т. pyriformis + бактерии Bti», сохраняющая ларвицидные свойства бактерий в течение 72 недель (срок наблюдений).

Материалы диссертации были использованы в педагогической работе на курсах, организованных ВОЗ для стран Европейского региона «Малярия и борьба с ней» (Москва, 2002г.) и для специалистов центров Госсанэпиднадзора Москвы и Московской области (2001-2002гг.), на курсах по систематике, морфологии, биологии, экологии переносчиков малярии Средней Азии и методам борьбы с ними (республика Таджикистан, г. Душанбе, 2004), а также на курсах усовершенствования для эпидемиологов, энтомологов ЦГСЭН на медико-профилактическом факультете ППОТОУ ММА им. И.М.Сеченова (2000-2004гг.)

Внедрение результатов исследования в практику. Материалы исследований по диссертации использованы в следующих нормативно-методических документах, разработанных с участием автора:

1. СанПин 3.2.1333-03 «Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации». Утверждены Министерством здравоохранения РФ 28.05.03 г. Зарегистрированы в Министерстве Юстиции РФ 09.06.03 №4662

9

2. Дезинсекция 3.5.2 «Борьба с комарами, выплаживающимися в подвальных помещениях» МУ 3.5.2.705-98. Минздрав России, Москва-1998

3. Профилактика паразитарных заболеваний 3.2. «Малярийные комары и борьба с ними на территории Российской Федерации» МУ 3.2.974—00. Минздрав России, Москва-2000.

4. Дезинсекция 3.5.2. Методы определения эффективности инсектицидов, акарицидов, регуляторов развития и репеллентов, используемых в медицинской дезинсекции. МУК 3.5.2. - 1759-03

5. Методические указания «Эпиднадзор за паразитарными болезнями». МУК 3.2.1756-03

6. Получены патенты на изобретение:

• «Штамм бактерий Bacillus sphaericus, предназначенный для получения препарата, активного против комаров» Патент № 2080066, 1997

• «Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var.israelensis , предназначенный для получения препарата, активного против личинок комаров». Патент на изобретение № 2122791, 1998

7. Штаммы депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.

Апробация работы. Основные результаты исследования были доложены и обсуждены со специалистами на чтениях, посвященных 60-летию кафедры медицинской энтомологии в РМАПО (1996), на Международном генетическом конгрессе в Бирмингеме (Англия, 1993), на рабочей встрече ВОЗ по генетическим изменениям ларвицидных бактерий, используемых для борьбы с переносчиками в Кордобе (Испания, 1996), на 9ой Международной конференции по бациллам в Лозанне (Щвейцария, 1997), на VII Съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997), заседании общества протозоологов (Москва, 1999), на 10ой Международной конференции по бациллам в Бавено (Италия, 1999), на ежегодном координационном совещании (Annual Coordination

10

Workshop US AID CDR/CAR and INTAS European Union, Ben Gurion, Israel, april-may, 1999), Субрегиональном совещании экспертов по проблеме пестицидов из числа стойких органических загрязнителей, интегрированным системахМ защиты растений и контролю сельскохозяйственных вредителей и переносчиков инфекционных заболеваний (Санкт-Петербург, 2000 г), на конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 2002), в отделе биохимии Кембриджеского Университета (Англия, 2003), на Бюро отделения профилактической медицины РАМН (Москва, 2003), на Ученом Совете ИМПиТМ им. Е.И.Марциновского ММА им. И.М.Сеченова, на коллоквиумах отдела медицинской энтомологии.

Диссертация апробирована на заседании Специализированной комиссии по предварительной экспертизе диссертаций в ИМПиТМ им. Е.И.Марциновского ГОУ ММА им. И.М.Сеченова (протокол №77 от 18 ноября 2003 г.).

Публикации по теме работы. Результаты диссертации отражены в 26 печатных работах (из них 6 в зарубежных изданиях), 1 СанПиНе, 4 методических указаниях, 2 патентах.

Положения, выносимые на защиту.

1. Направленный поиск природных видов и штаммов энтомопатогенных бактерий, выделение генов токсинообразования, получение рекомбинантных штаммов - продуцентов биологических инсектицидов, перспективных для промышленного производства, позволяют расширить возможности, повысить эффективность биологического метода борьбы с переносчиками возбудителей болезней и кровососущими насекомыми. Изучение выделенных нами штаммов Brevibacillus laterosporus доказало способность некоторых штаммов продуцировать кристаллы, обладающие инсектицидной активностью, что делает этот вид потенциальным кандидатом для биологической борьбы с кровососущими комарами. В результате проведения комплексных исследований по

t

11

выделению и изучению природных бактериальных изолятов, получению генов токсинообразования и создания рекомбинантного штамма Methylobacillus flagellatum с клонированным геном синтеза Сгу4В токсического белка Bti предложены новые, обладающие инсектицидной активностью штаммы Bacillus thuringiensis var.israelensis 1-5 и Л2 и штамм Bacillus sphaericus 16 - S25, включенные во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов, перспективных продуцентов биологических инсектицидов для борьбы с двукрылыми насекомыми.

2. Продолжительность действия биологических препаратов зависит от влияния ряда биотических и абиотических факторов. При этом выраженность воздействия одних и тех же факторов на различные биологические агенты существенно отличается. Сроки действия Bti и Bsph значительно варьируют в присутствии погибших личинок комаров и при увеличении исходной концентрации споро-кристаллической смеси. Наличие первого условия более важно для Bsph , а второго - для Bti.

Воздействие даже слабого неионизирующего излучения (микроволн и магнитных полей) приводит к снижению эффективности биологических препаратов. Поэтому антропогенные источники таких излучений могут опосредованно влиять на эффективность биологической борьбы с насекомыми.

3. Контакт простейших и энтомопатогенных бактерий потенциирует ларвицидные свойства последних. Обнаруженный феномен имеет универсальный характер образования симбиотической системы. При кратковременном контакте простейшие (Tetrahymena pyriformis и Entamoeba moshkovskii) увеличивают основные ларвицидные свойства энтомопатогенных бактерий Bti, Bsph, В. laterosporus и рекомбинантного штамма М. flagellatum (снижение эффективных концентраций и увеличение скорости действия). При длительном контакте инфузории Т. pyriformis пролонгируют инсектицидное действие бактерий Bti. Смесь Т. pyriformis и

12

Bti в условиях изолированных природных водоемов на личинках малярийных комаров первой генерации обеспечила их отсутствие на протяжении сезона потенциальной передачи малярии (2 месяца). Взаимодействие Т. pyriformis и Bti в питательной среде позволило без дополнительного введения бактерий поддерживать активность симбиотической системы на протяжении длительного времени -72 недели (срок наблюдений).

Список литературы
Цена, в рублях:

(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)
1425
Скачать бесплатно 22934.doc 





Найти готовую работу


ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:


Связаться

Доставка любой диссертации из России и Украины



Ссылки:

Выполнение и продажа диссертаций, бесплатный каталог статей и авторефератов

Счетчики:


© 2006-2016. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.