У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ
Заказать диплом, курсовую, диссертацию


Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Понравилось
Не понравилось





Книга жалоб
и предложений

 





Название Изучение антимикробный пептидов из целомоцитов пескожила Arenicola marina L
Количество страниц 150
ВУЗ МГИУ
Год сдачи 2010
Бесплатно Скачать 22973.doc 
Содержание Содержание
Оглавление

Стр.

ВВЕДЕНИЕ...5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...10

1.1 Краткая история вопроса... 10

1.2 Структурное разнообразие АМП... 12

1.3 Молекулярная биология антибиотических пептидов... 27

1.4 Механизмы антимикробного действия антибиотических пептидов... 36

1.5. К вопросу о разнообразии антимикробных пептидов... 50

1.6 Функциональные свойства АМП, отличные от антимикробной активности... 52

1.7 Прикладные исследования... 55

1.8 О состоянии современных знаний об АМП у разных групп животных... 56

1.9 Заключение... 59

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...61

2.1 Получение биологического материала... 61

2.2 Цитохимические методы... 62

2.3 Экстрагирование катионных пептидов... 63

2.4 Методы электрофореза... 63

2.5 Методы окраски пептидов в полиакриламидных гелях... 65

2.6 Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография... 66

2.7 Методы определения концентраций пептидов... 66

2.8 Методы определения дисульфидных связей в молекулах пептидов... 67

2.9 Методы определения молекулярной массы пептидов... 68

2.10 Процедура переноса пептидов на PVDF мембрану... 69

2.12 Определение аминокислотной последовательности пептидов... 69

2.13 Методы определения антимикробной активности пептидов... 70

2.14 Определение воздействия пептида на проницаемость внутренней мембраны E.coli... 74

2.15 Метод определения гемолитической активности пептидов... 76

2.16 Метод оценки хемотаксической активности целомоцитов пескожила... 77

2.17 Статистическая обработка результатов... 77

2.18 Использованные для сравнительных исследований препараты антимикробных пептидов были получены из следующих источников:... 78

2.19 Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей... 78

4

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...79

3.1 Анализ препаратов... 79

3.2 Выделение и очистка антимикробных пептидов из целомоцитов пескожила... 85

3.2.1 Выделение и очистка ареницинов... 85

3.2.2 Определение аминокислотной последовательности ареницинов... 91

3.2.3 Выделение и очистка других катионных антимикробных пептидов... 91

3.4 Изучение функциональных свойств ареницина-1... 102

3.4.1 Исследование антимикробной активности in vitro... 102

3.4.1.1 Изучение влияния различных условий среды на проявляемую ареницином антимикробную активность... 104

4. 3. 2 Изучение влияния ареницина-1 на изменение проницаемости цитоплазматической мембраны грам-отрицательной бактерии Escherichia coli ML-35p... 110

4.3.3 Изучение гемолитической активности ареницинов... 115

4.3.4 Взаимодействие ареницина-1 с лизоцимом человека... 118

4.3.5 Изучение способности арницина-1 вызывать направленную миграцию целомоцитов пескожила... 119

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...121

4.1 Анализ препаратов целомоцитов... 121

4.2 Выделение, очистка и определение первичной структуры ареницинов... 122

4.3 Выделение, очистка и характеристика других антимикробных пептидов из

целомоцитов пескожила... 128

4. 4 Функциональные свойства ареницина-1... 130

4.4.1 Антимикробная активность in vitro... 130

4. 4. 2 Влияние ареницина-1 на изменение проницаемости цитоплазматической мембраны грам-отрицательной бактерии Escherichia coli ML-35p... 136

4.4.3 Гемолитическая активность ареницина-1... 140

4.4.4 Взаимодействие ареницина-1 с лизоцимом... 142

4.4.5 Хемотаксическая активность ареницина-1 в отношении целомоцитов пескожила 145

5. ВЫВОДЫ...148

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ... 150

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Микроорганизмы представляют собой постоянную угрозу для всех многоклеточных животных, которые сохраняют способность к самоподдержанию и самовоспроизведению лишь постольку, поскольку могут противостоять агрессивному потенциалу окружающей их микробной флоры. Необходимым условием эволюции всего живого являлось развитие защитных механизмов, т.е. способности противостоять инфекциям - иммунитета.

Иммунитет представляет собой совокупность факторов, способных распознавать, изолировать, уничтожать или ограничивать экспансию чужеродных элементов. Уже в середине 20-го века иммунологи четко различали иммунитет естественный и приобретенный. Первый из них понимали как «невосприимчивость, обусловленную врожденными биологическими особенностями, присущими данному виду, как наследуемый видовой признак» (цит. По А. Зильберу). Приобретенный иммунитет рассматривали как резистентность к инфекции, возникшую в течение индивидуальной жизни вследствие контакта с потенциальным патогеном. В дальнейшем для обозначения естественного иммунитета были предложены термины «врожденный» и «неспецифический». Приобретенный иммунитет определили как «специфический» или «адаптивный».

У беспозвоночных и древнейших позвоночных животных (круглоротых) защиту от инфекций и паразитарных инвазий обеспечивает совокупность факторов врожденного иммунитета.

У позвоночных животных в дополнение к врожденной появилась система иммунитета адаптивного, основными чертами которого являются индуцибельность, высокая специфичность, формирование иммунологической «памяти». Врожденный иммунитет обеспечивает защиту на первых этапах взаимодействия организма с патогенами и играет важную роль в модуляции и регулировании дальнейших адаптивных процессов. Именно с помощью механизмов врожденного иммунитета осуществляется контроль над уровнем естественной микрофлоры организма.

В последнее время все большее значение приобретает изучение механизмов врожденного иммунитета. Особый интерес представляет группа беспозвоночных животных. Успешное выживание в среде, изобилующей микроорганизмами

6

свидетельствует об эффективности функционирования их защитных систем. При этом многие процессы, из которых слагается сложнейший иммунный ответ у позвоночных, у беспозвоночных нередко представлены в более простой и доступной для анализа форме.

Врожденный иммунитет складывается из клеточного и гуморального звеньев. Наиболее распространенными и универсальными являются механизмы фагоцитоза и агрегации клеток полости тела, гемоцитов или целомоцитов у беспозвоночных, и нейтрофилов и макрофагов у млекопитающих. Гуморальные факторы представлены белками плазмы крови или целомической жидкости (Кокряков В.Н., 1999; Хаитов, 2000; Климович В.Б., 2002).

В течение последних 20 лет стало ясно, что традиционное представление об эффекторных молекулах врожденного иммунитета является неполным без учета роли катионных антимикробных пептидов (АМГТ). Открытие этих веществ вызвало очень большой интерес исследователей во всем мире, и накопленные к настоящему моменту сведения позволяют сделать вывод о том, что антибиотические пептиды являются ведущими молекулярными компонентами системы врожденного иммунитета. Эти вещества являются древнейшими факторами защиты всех видов живых организмов и обнаруживаются в органах и тканях, для которых наиболее вероятен контакт с внешним патогеном, (поверхностные и слизистые эпителии, гранулы фагоцитарных клеток, гемолимфа и целомическая жидкость), что косвенно свидетельствует в пользу их участия в обеспечении неспецифической антимикробной резистентности (Кокряков, 1999).

К АМП относят группу пептидо^ обладающих следующими свойствами: они положительно заряжены (минимальный положительный заряд +2, чаще +4,+5, в зависимости от содержания аминокислотных остатков лизина, аргинина и гистидина), имеют низкую молекулярную массу (не более ЮкДа) и формируют такую третичную структуру, в которой гидрофобные и гидрофильные боковые радикалы аминокислот пространственно разобщены, т.е. молекула является амфипатической (важную роль в стабилизации подобной структуры играют внутримолекулярные дисульфидные связи). Эти свойства лежат в основе механизма действия АМП на клетки патогенов. Действие подавляющего большинства АМП направлено на дестабилизацию и в конечном итоге разрушение клеточной мембраны, что вызывает серьезные системные повреждения, несовместимые с жизнедеятельностью микробной клетки.

7

Помимо трех указанных выше общих качеств АМП демонстрируют большое разнообразие первичных и надпервичных структур и имеют разный характер функциональной активности.

Многие АМП проявляют высокую активность против грам-отрицательных и грам-положительных бактерий, грибов, некоторых оболочечных вирусов (дефенсины), некоторые цитотоксичны в отношении эукариотических клеток. Другие пептиды имеют более ограниченный спектр действия (цекропины, профенины). Даже небольшие изменения в структуре молекулы могут оказывать значительное влияние на ее активность. Понимание соответствия между структурой и активностью является одним из важнейших направлений исследований. В дополнение к основной функции умерщвления микроорганизмов, некоторые изученные антимикробные пептиды (в частности дефенсины человека) обладают целым спектром функциональных свойств, свидетельствующих об их участии во взаимодействии систем врожденного и приобретенного иммунитета (хемотаксическим, способностью к модуляции продукции цитокинов, антисептическим, кортикостатическим и др.) (Кокряков, 1999; Gennaro, Zanetti, 2000; Yang etal., 2004).

Показана возможная роль и в других физиологических процессах (атерогенезе, заживлении ран и свертывании крови (а-дефенсины) (Raj, Dentino, 2002)), есть данные о воздействии дефенсинов человека и насекомых на ионные каналы (MacLeod et al., 1991; Bateman et al, 1996).

Все это указывает на многофункциональность антимикробных пептидов, реализация которой может в значительной степени определять эффективность защитных реакций организма (Кокряков, 1999).

Необходимо учитывать, что in vivo АМП действуют кооперативно друг с другом и другими факторами системы врожденного иммунитета, обеспечивая наиболее эффективную защитную реакцию организма-хозяина.

Хотя исследования АМП животных проводятся уже более 40 лет, видовой состав организмов, которые были изучены в этой области, составляет ничтожную часть от общего числа известных видов.

Для понимания закономерностей эволюции механизмов противоинфекционной защиты, необходимо дальнейшее накопление знаний о структуре и функциональных свойствах АМП у разных видов живых организмов. С точки зрения сравнительной биохимии представляет интерес изучение АМП у представителей ключевых в эволюционном плане групп животных.

8

Поиск новых АМП важен не только с фундаментальной, но и с практической точки зрения. Как антимикробные агенты АМП весьма перспективны для разработки на их основе новых лекарственных препаратов, «антибиотиков животного происхождения». Они лишены многих недостатков свойственных традиционно применяемым антибиотикам (против их действия редко вырабатывается резистентность, не развивается эндотоксемия), и представляют собой сформировавшиеся в процессе эволюции молекулярные матрицы, естественные для организмов (Кокряков, 1999; Gennaro, Zanetti, 2000; Gallo et al., 2002; Bevins, 2003; Yang et al., 2004).

Выбор в качестве объекта исследований представителя класса многощетинковых червей кл. Polychaeta (т. Annelida) определялся тем, что, в соответствии с современными представлениями, полихеты являются ключевой группой в эволюции трохофорных животных, давшей начало моллюскам и членистоногим. Антимикробные пептиды у этих животных еще не были обнаружены другими исследователями, хотя были описаны другие (высокомолекулярные) белковые антимикробные факторы (Cooper et al., 2002).

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы было выявление и изучение структурных и функциональных свойств антимикробных пептидов из целомоцитов пескожила Arenicola marina L.. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Поиск, идентификация и очистка антимикробных пептидов;

2. Изучение физико-химических свойств, определение первичной структуры выделенных пептидов;

3. Изучение функциональных свойств выявленных пептидов.

Научная новизна

В работе впервые было проведено комплексное изучение антимикробных пептидов

целомоцитов пескожила и показано, что они обладают целым спектром

антимикробных пептидов.

Был выявлен и очищен до гомогенного состояния ряд антимикробных пептидов.

Среди выделенных пептидов было охарактеризовано две изоформы новых

антимикробных пептидов названных нами ареницинами, которые можно отнести к

новому структурному семейству.

9

Получены данные, характеризующие антимикробную и гемолитическую активность ареницина-1.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Целомоциты пескожила содержат целый ряд катионных антимикробных пептидов Из целомоцитов выделено в чистом виде 11 антимикробных пептидов. Среди всех охарактеризованных антимикробных пептидов особый интерес представляют новые антимикробные пептиды ареницины. Ареницины являются пептидами с уникальной структурой, принадлежащей к новому структурному семейству.

2. Ареницин-1 является эффективным антибиотическим агентом с широким спектром действия на микроорганизмы, причем его антимикробная активность остается стабильной в широком диапазоне условий. Как и у подавляющего большинства антимикробных пептидов бактерицидное действие ареницина-1 является следствием взаимодействий молекулы пептида с цитоплазматической мембраной клетки. По эффективности микробоцидного действия ареницин-1 сравним с самыми сильными пептидными антибиотиками. Несмотря на присущую ареницину способность вызывать гемолиз эритроцитов, гемолитическая активность начинает проявляться при высоких концентрациях пептида, намного превышающих минимальные ингибирующие концентрации, установленные в отношении микроорганизмов.

Список литературы
Цена, в рублях:

(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)		 1425
Скачать бесплатно 22973.doc 





Найти готовую работу


ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:


Связаться

Доставка любой диссертации из России и Украины

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ


Ссылки:

Выполнение и продажа диссертаций, бесплатный каталог статей и авторефератов

Счетчики:

Besucherzahler
счетчик посещений

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.