Бесплатно скачать, заказать диплом, курсовую, диссертацию Иммуноферментные тесты определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора в гематологической практике

У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ

Сделать закладку на сайт

Заказать диплом, курсовую, диссертацию

Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Книга жалоб
и предложений

Название	Иммуноферментные тесты определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора в гематологической практике

Количество страниц	72

ВУЗ	МГИУ

Год сдачи	2010

Бесплатно Скачать	22976.doc

Содержание	Содержание Оглавление Стр. Введение 4 1.Обзор литературы 7 1.1 Значение определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора 7 1.2 Характеристика современных методов анализа, используемых для определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового 17 рецептора Собственные результаты 2. Материалы и методы 23 2.1 Получение конъюгатов В12-БСА и фол-БСА 23 2.2 Получение конъюгатов Нсу-ПАК и Нсу-БСА 24 2.3 Получение антисывороток 24 2.4 Проведение иммуноферментного анализа 25 3. Результаты исследований 28 3.1 Разработка иммуноферментного метода определения витамина В12, фолатов и гомоцистеина. 28 3.2 Приготовление растворов калибраторов 30 3.3 Оптимизация иммуноферментного анализа витамина В12 31 3.4 Разработка и оптимизация твердофазного иммуноферментного анализа для определения фолиевой кислоты 37 3.5 Постановка иммуноферментного анализа для количественного определения 40 витамина В12 и фолатов 3.6 Разработка метода определения гомоцистеина 43 3.7 Разработка метода определения трансферринового рецептора 48 3.8 Клиническое использование разработанных тестов 51 3.8.1 Определение витамина В12 и фолиевой кислоты при ряде 51 гематологических заболеваний 3.8.2 Определение гомоцистеина при гематологических и микрореологических заболеваниях 55 3.8.3 Определение трансферринового рецептора при гематологических 56 нарушениях Заключение 59 Выводы 71 Список литературы 72 Введение Список сокращений CBS - цистатион Р-синтетаза БиМФ — дезоксиуридинмонофосфат dTTP - деокситимидинтрифосфат GAR - глицинамид рибонуклеотид Нв - гемоглобин I125'радиоактивный иод МТНФ - метилтетрагидрофолат R - степень модификации БСА SAH - Б-аденозил-Ь-гомоцистеин THFs - тетрагидрофолат АИГА - аутоиммунная гемолитическая анемия АХВЗ - анемии хронических воспалительных заболеваний БСА - бычий сывороточный альбумин ВЖХ - высокоразрешающая жидкостная хроматография Д - оптическая плотность ДГФ - дигидрофолат ДМФА - абсолютный диметилформамид ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота ДНТ - дефект нервной трубки ЖДА - железодефицитная анемия ИФА - иммуноферментный аналш (или в международной классификации ELISA) М - молекулярная масса МА - мегалобластная анемия МДС - миелодиспластический синдром МКАТ - концентрация моноклональных антител MTHFR - метилентетрагидрофолатредуктаза МоАт - моноклональные антитела м-ТГФ - метил-тетрагидрофолат НГХ - наследственный гемохроматоз Нсу - гомоцистеин ОФД — ортофенилендиамин ПА - пернициозная анемия ПАК - полиакриловая кислота ПНГ - параксизмальная ночная гемоглобинурия ПХ - пероксидаза из корня хрена ПЦР - полимеразная цепная реакция РИА - радиоиммунный анализ РНК - рибонуклеиновая кислота С - концентрация Со57" радиоактивный изотоп кобальта Con - конъюгат ТМБ - тетраметиленбензидин ТфР - трансферриновый рецептор ФИА - флуоресцентный иммуноанализ ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор ФСБР-Т - фосфатно-солевой буферный раствор с 0,05 % твин-20 ВВЕДЕНИЕ Дифференциальная диагностика анемий по-прежнему остается актуальной проблемой гематологии. В связи с этим разработка и внедрение в практику лабораторных методов, позволяющих уточнить характер анемий, обусловленных разными причинами, имеет • существенное значение как с научной, так и с практической точек зрения. Показано, что определение и контроль уровней витамина В12 и фолатов целесообразно в клинической • гематологии. Витамин В12 и фолаты необходимы для нормального метаболизма в организме (синтез ДНК, обмен жирных кислот и др.). Дефицит этих витаминов вызывает нарушение функции быстро пролиферирующих клеток и в первую очередь мегалобластную анемию, а также неврологические и нейропсихические изменения. Кроме того, по концентрации витамина В12 в ряде случаев проводится дифференциальная диагностика хронических миелопролиферативных заболеваний. Нарушение обмена фолиевой кислоты и вызванное этим увеличение в крови концентрации гомоцистеина (Нсу), как продукта метаболизма фолатов, ведет к сердечно-сосудистым заболеваниям и тромбозам, в основе которых лежит токсическое действие гомоцистеина на эндотелий сосудов. Метаболизмы витамина В12 и фолиевой кислоты тесно взаимосвязаны, и дефицит одного из них влияет на биохимические реакции, контролируемые этими витаминами. Биохимические механизмы, посредством которых дефицит этих витаминов приводит к анемиям, на сегодня еще не • полностью ясен, хотя и доказано, что наблюдается дефект синтеза ДНК при сохранном синтезе РНК и белков. Скорее всего, появление дефектной ДНК вызвано нарушениями в реакции превращения урацил-монофосфата в тимидин-монофосфат, который, включаясь в ДНК, необходим для образования ее больших тяжей, требуемых для формирования хромосомы. Таким образом, поскольку содержание в организме витамина В12, фолиевой кислоты и гомоцистеина взаимосвязаны, определение их концентраций важно для точной диагностики заболеваний, а также для контроля проводимой терапии. Среди анемий различной этиологии значительное место занимают анемии хронических воспалительных заболеваний (АХВЗ). По ряду признаков они отличаются от истинных железодефицитных анемий. Однако, без дополнительных исследований их трудно дифференцировать с истинным дефицитом железа. Одним из информативных дифференциальных показателей является концентрация трансферринового рецептора. • Трансферриновый рецептор (ТфР) является мембранным гликопротеином, выполняющим роль медиатора в передаче железа из плазмы в клетку. Этот процесс осуществляется путем • связывания трансферрина плазмы, насыщенного железом, с трансферриновым рецептором с последующей интернализацией образовавшегося комплекса в эндо плазматическую везикулу путем эндоцитоза, где железо освобождается из комплекса с белком при уменьшении рН. ТфР освобождается из ретикулоцитов во время их созревания до эритроцитов. ТфР, 5 находящийся в плазме, представляет собой растворимые фрагменты экстрацеллюлярной части рецептора. Уровень растворимого трансферринового рецептора, присутствующего в плазме, позволяет судить о состоянии гемопоэза, поскольку при недостатке в клетке свободного железа происходит увеличение синтеза ТфР, а следовательно, и увеличение поступления железа в клетку. При избытке железа в клетке синтез рецептора прекращается. Эритроидные клетки содержат основную массу трансферринового рецептора в организме. В норме плазма содержит небольшое количество ТфР (1,5—2,5 мкг/мл). Концентрация ТфР в плазме хорошо коррелирует с общей массой рецептора на незрелых эритроидных клетках. В связи с этим при истинных ЖДА уровень растворимого трансферринового рецептора резко повышен в отличие от анемии воспалений ¦. и хронических заболеваний. Поэтому определение уровня трансферринового рецептора включают в методы дифференциальной; диагностики этих анемий: Поскольку все указанные соединения находятся в сыворотке крови в крайне незначительных количествах, определение их возможно лишь современными высокочувствительными методами анализа, такими как радио-, флюро- или ферментоиммунными. В настоящее время отечественных наборов для определения витамина В12, фолатов, гомоцистеина и ТфР нет, а выпускаемые за рубежом - дороги и их применение возможно только при наличии специального оборудования - автоматизированных «закрытых» систем. В связи с этим целью нашей работы является разработка и внедрение в клиническую практику иммуноферментных методов количественного определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора. Задачи исследования 1. Получить конъюгаты витамина В12 с бычьим сывороточным альбумином (БСА), фолатов с БСА, S - аденозил - L - гомоцистеина (SАН) с БСА, SAH с полиакриловой кислотой (ПАК), необходимые при проведении иммуноферментного анализа для использования в качестве антигенов и иммуносорбентов. 2. Оптимизировать параметры проведения иммуноферментной реакции для количественного определения В12, фолатов, гомоцистеина (Нсу). 3. Провести эксперименты по получению реагентов для иммуноферментного анализа ТфР (очищенного препарата ТфР и кроличьих антисывороток к ТфР) и разработать методику количественного определения ТфР методом твердофазного ИФА. 4. Изучить аналитические характеристики сконструированных тест-систем (специфичность, чувствительность, воспроизводимость, сходимость результатов) и провести 6 сравнительный анализ полученных результатов с данными других иммунохимических методов. 5. Оценить клиническую информативность разработанных методов количественного определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферриновго рецептора. Научная новизна Разработан оригинальный подход для получения антисыворотки против гомоцистеина на основании использования конъюгата 8-аденозил-Ь-гомоцистеина с полимером (полиакриловой кислотой), обеспечивший получение антисывороток с высоким уровнем специфических антител и высокой константой аффинности, необходимых для целей ИФА. Разработаны иммуноферментные количественные методы анализа витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора. Показана высокая информационная значимость комплексного определения витамина В12, фолиевой кислоты и трансферринового рецептора для дифференциальной диагностики анемий. Показана целесообразность контроля уровня гомоцистеина у больных с повышенным риском развития тромбозов и микроциркуляторными нарушениями для выбора оптимальной тактики лечения. Практическая значимость 1. Разработаны высокочувствительные и специфичные методики количественного определения витамина В12, фолатов, гомоцистеина и трансферринового рецептора на основе твердофазного иммуноферментного анализа. 2. Разработаны и утверждены Ученым Советом Гематологического научного центра РАМН методические рекомендации «Иммуноферментный метод определения витамина В12 и фолиевой кислоты» (протокол № 4 от 28 мая 2002 г.). 3. С 2001 г. разработанные лабораторные тесты внедрены в клиническую практику ГНЦ РАМН. 4. Показана целесообразность динамического контроля уровня гомоцистеина у больных с повышенным риском развития тромбозов. Апробация работы Материалы, изложенные в диссертации, доложены на научной конференции ГНЦ РАМН (Москва, 2004). Результаты диссертации обсуждены на заседании проблемной комиссии «Опухоли лимфатической системы, патология красной крови, порфирии» ГНЦ РАМН (Москва, 1 июля 2004).

Список литературы

Цена, в рублях: (при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)	1425

Скачать бесплатно	22976.doc

Найти готовую работу

ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:

Связаться

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ

15.04.24 Задачи, условия и этапы организации экспериментальной работы

15.04.24 Критерии качества преподавания

15.04.24 Категория нормы в обучающей деятельности

Архив материала для курсовых и дипломных работ

Ссылки:

Счетчики:

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.