У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ
Заказать диплом, курсовую, диссертацию


Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Понравилось
Не понравилось





Книга жалоб
и предложений

 





Название Покоящиеся формы Бактерий рода Mycobacterium: получение, Биохимические факторы реактивации
Количество страниц 98
ВУЗ МГИУ
Год сдачи 2010
Бесплатно Скачать 23156.doc 
Содержание Содержание
2 Оглавление

Глава 1. Обзор литературы.---------------------------------------6

1.1. Анабиоз как явление природы.---------------------------------6

1.2. Стресс у бактерий и реакция на него.------------------------------7

1.2.1. Выживание бактерий в процессе длительного голодания.------------------9

1.2.2. Стационарная фаза развития культуры.--------------------------10

1.2.3. Факторы, определяющие поведение бактериальной популяции в условиях недостатка питательных веществ.-------------------------------------11

1.2.4. Биохимические изменения бактериальной клетки в условиях голодания.--------12

1.2.5. Генетическая регуляция переживания бактериальными клетками неблагоприятных

1.3. Покоящиеся формы неспорулирующих бактерий.---------------------19

1.4." Выход бактерий из покоящегося состояния.--------------------------22

1.5. Социальное поведение бактерий.-------------------------------29

1.6. Туберкулез и латентность инфекции.----------------------------30

1.6.1. Получение латентных форм Mycobacterium tuberculosis на экспериментальных

1.6.2. Модели покоящихся форм М tuberculosis in vitro.---------------------33

Глава 2. Материалы и методы------------------------------------35

2.1. Выращивание бактериальных культур---------------------------35

2.2. Оценка жизнеспособности клеток.-----------------------------36

2.3.Определение общего числа клеток (ОЧК)---------------------------36

2.4. Получение супернатантов для восстановления «некультивируемых» форм.--------36

2:5. Получение рекомбинантного фактора Rpf.---------------------------36

2.6. Аффинная хроматография с использованием антител.--------------------37

2.7. Реактивация «некультивируемых» форм.----------------------------38

2.8. Измерение численного распределения клеток.------------------------38

2.9. Флуоресцентная микроскопия.---------------------------------39

2.10. Сканирующая электронная микроскопия.--------------------------39

2.11. Измерение окислительно-восстановительного потенциала.---------------39

2.12. Трансформация культуры М. smegmatis.---------------------------40

2.13. Процедура со-культивирования.------------------------------40

2.14; Иммуноферментный анализ.----------------------------------40

2.15. Получение СН, обладающего ингибиторным действием на рост клеток.---------40

3

2.16. Тестирование активности ингибирующих супернатантов.---------------41

2.17. Гель - фильтрация СН с ингибирующей активностью.------------------41

2.18. Ультрафильтрация СН с ингибирующей активностью.------------------41

2.19. Гидрофобная хроматография.------------------------------41

2.20. Тонкослойная хроматография (ТСХ).----------------------------42

2.21. Получение фракции липидов из супернатанта с ингибирующей активностью.----42

2.22. Ядерный магнитный резонанс (ЛМР).----------------------------42

2.23. Инфракрасная спектроскопия ингибирующего вещества (ИВ).--------------42

2.24. Включение радиоактивной метки.------------------------------43

2.25. Хромато-масс-спектроскопия.--------------------------------43

Глава 3. Результаты.------------------------------------------45

3.1. Получение «некультивируемых» форм микроорганизмов семейства Nocardiaceae.—45

3.1.1. Поведение культуры Rhodococcus rhodochrous в условиях недостатка питательных

DOTTTO/TTJ _ — —— —— _ . /1 ^

Dtii^tvi D,~•"————————-•—————«——————————————..————————————— *f ^7

3.1.2. Образование «некультивируемых» форм культурой Mycobacterium smegmatis, как результат действия многих факторов.----------------------------48

3.1.3. Формирование покоящихся клеток культурой Mycobacterium tuberculosis при длительном инкубировании в стационарной фазе.---------------------51

3.1.4. Микроскопия клеток, проявляющих способность образовывать покоящиеся формы.—53

3.1.5. Образование «некультивируемых» форм у мутантных клеток М.smegmatis.------56

3.2. Изучение вещества, накапливающееся в культуральной жидкости бактерий при переходе в «некультивируемое» состояние.--------------------------59

3.2.1. Тестирование активности и физико-биологические характеристики ИВ.--------60

3.3. Восстановление покоящихся форм.-----------------------------82

3.3.1. Разработка процедуры реактивации «некультивируемых» клеток.------------82

3.3.2. Биохи
мический анализ супернатантов, проявляющих активирующую активность.--92

3.3.3: Исследование трансформантов М. smegmatis, содержащих плазмиду со встроенным

Глава 4. Обсуждение.----------------------------------------98

ВВЕДЕНИЕ

Хорошо известно, что при попадании в неблагоприятные условия, многие бактерии способны переходить в покоящееся состояние. Это состояние характеризуется резким снижением метаболической, активности и полным» отсутствием деления. Ранее покоящееся состояние микроорганизмов связывали только со специализированными формами (спорами и цистами), образуемыми ограниченным числом бактерий. Однако сейчас становится ясно, что многие неспорулирующие; бактерии, в том числе и патогенные микроорганизмы, в определенных условиях могут переходить в покоящееся состояние, оставаясь при этом жизнеспособными. Под. покоящимся состоянием' мы понимаем такое, обратимое состояние бактериальной клетки, при котором уровень метаболической активности значительно снижен, а клетка может существовать в таком состоянии без деления длительное время; [Kaprelyants, 1993].Такие покоящиеся клетки, как правило, изменяют свою форму, утолщают клеточную стенку и становятся менее чувствительными:к агрессивным внешним воздействиям. И; хотя обычные микробиологические: методы зачастую не могут выявить микроорганизмы, находящиеся в покоящемся состоянии, такие бактерии при наступлении благоприятных условий способны продолжить рост.

До недавнего времени существование покоящегося состояния для микобактерий in vitro или in vivo не было установлено, хотя для ряда других неспорулирующих бактерий переход в покоящееся состояние экспериментально установлен.

Известно, что каждый третий человек на Земле латентно инфицирован возбудителем туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis, живя: с постоянным риском перехода в активную форму болезни. До сих пор нет единого понимания природы латентного состояния и механизмов, посредством которых оно регулируется. Существует распространенная точка зрения, что патогенные, медленно растущие микобактерий Mycobacterium tuberculosis или Mycobacterium leprae могут сохраняться в течение длительного времени in vivo после начала инфекции, переходя в покоящееся состояние [Gangadharam, 1995] [Parrish, 1998]. Предполагается, что такие покоящиеся клетки М tuberculosis могут сохраняться много лет в хозяине (латентная инфекция) с возможным последующим переходом в активное состояние, и, как следствие, активизацией болезни. Однако экспериментальные доказательства такого предположения практически не получены.

Ранее в нашей лаборатории было обнаружено, что клетки неспорулирующей бактерии; Micrococcus luteus в стационарной фазе при определенных условиях переходят в состояние, которое характеризуется низким уровнем метаболизма и потерей кул ьтивируемости клеток на твердых и жидких средах [Kaprelyants, 1993]. Для реактивации таких клеток необходимо было проведение процедуры, «оживления»- культивирование покоящихся клеток с добавлением в

5

жидкие среды ростовых факторов. Было обнаружено, что реактивирующей покоящиеся клетки способностью обладает секретируемый в культуральную среду белок М. luteus, названный Rpf (от английского resuscitation promoting factor). Согласно базам данных гомологичные гены rpf имеются в микроорганизмах рода Mycobacterium. Об этом также свидетельствуют результаты гибридизации и ПЦР со специфическими для rpf праймерами. Логично предположить, что продукты rpf-подобных генов в этих бактериях выполняют аналогичные ему функции. В частности, в М. tuberculosis имеется 5 генов и, может быть, они контролируют вход\выход из покоящегося состояния.

Несмотря на значимость изучения латентности туберкулеза, экспериментальная модель покоя клеток возбудителя не описана, тем более не установлена роль белков Rpf в этом процессе.

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ЖНК - жизнеспособные, но «некультивируемые» клетки

НК - «некультивируемость»

КОЕ - колониеобразующие единицы

МКР - метод конечных разведений

ОЧК - общее число клеток

СН - супернатант, полученный центрифугированием и фильтрованием через 0.2 мкм фильтр

бактериальных культур

ИВ - ингибирующее вещество, образующееся в результате получения «некультивируемых»

форм бактерий

СССР- карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон

СУС - смерть, ускоряемая субстратом

УМБ - ультрамикробактерии

МПБ — мясо-пептонный бульон

Сатон - синтетическая среда Сатона

мСатон - модифицированная синтетическая среда Сатона

HdeB -синтетическая среда Hartmans de Bont

MHdeB - модифицированная синтетическая среда HdeB

МТБ - Mycobacterium tuberculosis

СТС - 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride
Список литературы
Цена, в рублях:

(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)		 1425
Скачать бесплатно 23156.doc 





Найти готовую работу


ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:


Связаться

Доставка любой диссертации из России и Украины

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ


Ссылки:

Выполнение и продажа диссертаций, бесплатный каталог статей и авторефератов

Счетчики:

Besucherzahler
счетчик посещений

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.