У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ
Заказать диплом, курсовую, диссертацию


Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Понравилось
Не понравилось





Книга жалоб
и предложений

 





Название Создание рекомБинантнык аденовирусов, экспрессируютцих гены факторов роста кровеносный сосудов и изучение влияния этик вирусов на ангиогенез in vivo
Количество страниц 115
ВУЗ МГИУ
Год сдачи 2010
Бесплатно Скачать 23249.doc 
Содержание Содержание
ОГЛАВЛЕНИЕ.

Принятые сокращения 5

ВВЕДЕНИЕ 7

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

1.1. Аденовирусы как векторы для переноса генетической информации. 12

1.1.1. Общая характеристика аденовирусов человека.

13

1.1.2. Векторы на основе аденовирусов человека. 15

1.1.3. Особенности структурно-функциональной организации аденовируса птиц CELO. 2 0

1.1.4. Векторы на основе аденовируса птиц CELO. 2 5

1.2. Факторы роста кровеносных сосудов. 2 9

1.2.1. Ангиогенин. 30

1.2.1.1. История открытия и свойства белка ангиогенина. 30

1.2.1.2. Роль ангиогенина в неоваскуляризации.

33

1.2.1.3. Внутриклеточные функции ангиогенина.

36

1.2.1.4. Другие функции белка. 38

1.2.2. VEGF (фактор роста эндотелия сосудов). 40

1.2.2.1. Свойства и функции белка. 4 0

1.2.2.2. VEGF А. 4 3

1.2.2.3. Другие члены семейства VEGF. 4 5

1.2.2.4. Исследование способности VEGF индуцировать ангиогенез в организме животных и человека. 47

1.2.3. Другие факторы роста кровеносных сосудов.

50

2 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 54

2.1. Материалы. 54

2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы. 54

2.1.2. Клеточные линии. 54

2.1.3. Плазмидные векторы. 54

2.1.4. Ферменты и другие реактивы. 5 5

2.1.5. Животные. 55

2.2. Методы. 55

2.2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК. 55

2.2.2. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК. 5 6

2.2.3. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами. 57

2.2.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле. 57

2.2.5. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля. 57

2.2.6. Лигирование фрагментов ДНК. 58

2.2.7. Трансформация клеток E.coli. 58

2.2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК. 5 8

2.2.9. Полимеразная цепная реакция. 59

2.2.10. Синтез дезоксиолигонуклеотидов. 60

2.2.11. Трансфекция клеток линии 293 или LMH для получения рекомбинантных аденовирусов. 60

2.2.12. Накопление вирусов. 61

2.2.13. Очистка и концентрирование аденовирусов. 61

2.2.14. Титрование вирусов. 62

2.2.15. Выделение вирионной ДНК. 62

3

2.2.16. Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом. 63

2.2.17. Трансфекция хорио-аллантоисной мембраны. 64

2.2.18. Определение активности секретируемой щелочной фосфатазы. 64

2.2.19. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН (PAGE-SDS).

65

2.2.20. Иммуноблоттинг (Western blot immunoassay).

65

2.2.21. Хирургические манипуляции с лабораторными животными. 66

2.2.22. Введение рекомбинантных вирусов в мышечные клетки. 66

2.2.23. Гистологический анализ. 67

2.2.24. Определение логфазы для микроорганизмов. 68

2.2.25. Определение влияния ангиогенина на рост микроорганизмов. 68

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 7 0

3.1. Конструирование рекомбинантных аденовирусов на основе генома аденовируса птиц CELO и генома аденовируса человека 5 серотипа. 7 0

3.1.1. Создание плазмидных конструкций, несущих гены ANG и VEGF. 7 0

3.1.2. Анализ экспрессии генов ANG и VEGF, содержащихся в плазмидных векторах. 71

3.1.3. Получение аденовирусов CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток. 7 6

4

3.1.4. Детекция экспрессии генов ANG и VEGF в культуре клеток, зараженных рекомбинантными аденовирусами CELO-ANG и CELO- VEGF. 8 4

3.2. Индукция неоваскуляризации в конечностях лабораторных животных после введения рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов. 8 6

3.2.1. Введение репортерных генов GFP и SEAP в клетки мышцы крысы при помощи рекомбинантных аденовирусов. 8 6

3.2.2. Индукция неоваскуляризации в мышцах крыс после введения рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов.

88

3.3. Исследование антимикробной активности ангиогенина. 93

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 101

ВЫВОДЫ 114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115

Введение



ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

б.о.е. - бляшкообразующая единица

ГКМ - гладкомышечные клетки

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

е.к. - единица карты

к.о.е. - колониеобразующая единица

кДНК - комплементарная ДНК

н. - нуклеотид

н.п. - нуклеотидная пара

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомальная РНК

ХАМ - хориоаллантоисная мембрана

ЭК - эндотелиальные клетки

Ad - аденовирус

ANG - ангиогенин

Ang - ангиопоэтин

BSA - бычий сывороточный альбумин

CAR - коксакьевирусный-аденовирусный рецептор

CELO - аденовирус птиц FAV1

FGF-2 - фактор роста фибробластов-2

GFP - зеленый флуоресцирующий белок

HCMV, CMV - цитомегаловирус человека

Hif-la - фактор, индуцирующий гипоксию-la

LMH - культура клеток гепатомы кур

Orf - открытая рамка считывания

рА - сигнал полиаденилирования

PBS - фосфатный солевой буфер

PIGF - плацентарный ростовой фактор

R - рецептор

SEAP - секретируемая щелочная фосфатаза

SPF - свободный от вирусных и бактериальных

контаминации

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов

ВВЕДЕНИЕ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

В настоящее время для доставки различных терапевтических генов в органы и ткани млекопитающих широко применяются векторы на основе вирусов человека и животных. Вирусные векторные системы являются перспективными, поскольку вирус эффективно проникает в клетки и не требует использования дополнительных средств улучшения эффективности трансфекции. Широко используемым инструментом для доставки генов в клетки млекопитающих являются векторы на основе аденовирусов.

Наше исследование направлено на создание генно-инженерных конструкций, индуцирующих рост кровеносных сосудов в конечностях млекопитающих в результате доставки в ткани конечностей аденовирусных векторов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов. В качестве средства доставки данных генов в мышцы лабораторных животных нами были использованы вирусные векторы на основе аденовируса человека типа 5 (Ad5) и аденовируса птиц CELO. Аденовирусные векторы широко применяются для транзиентной экспрессии генов в клетках млекопитающих in vivo и in vitro. Исследуется применение векторов на основе аденовирусов человека и животных в качестве живых рекомбинантных вакцин для ветеринарии и медицины, а также для генной терапии.

В качестве целевых генов для доставки в мышцы лабораторных животных мы использовали гены факторов роста кровеносных сосудов, поскольку возможность

8

регуляции роста кровеносных сосудов это одна из задач, стоящих перед медицинской наукой и практикой. Атеросклероз с постепенным сужением полости артерий и последующем уменьшением кровяного тока до сих пор остается одной из самых серьезных проблем в мире. Не смотря на то, что почти каждый орган в человеческом организме может быть поврежден, в большей мере заболеваемости подвержены: сердце (поражение венечной артерии), мозг (поражение церебральных сосудов) и нижние конечности (поражение периферических сосудов) [Rasmussen H.S. et al., 2002].

Известно, что в организме человека имеются естественные регуляторы роста кровеносных сосудов, способствующие образованию коллатералей, обходящих места закупорки артерий. Однако белки факторов роста кровеносных сосудов, при введении в организм, имеют короткий период полураспада [Takeshita S. et al. , 1994] , а для индукции роста сосудов нужно поддерживать необходимый уровень белка - ангиогена продолжительное время. Поэтому, для лечения ишемических заболеваний перспективными являются генно-терапевтические методы. Генная терапия предоставляет возможность для повышения в организме уровня белков - факторов роста кровеносных сосудов и поддержания его длительный период времени.

Существует множество факторов роста кровеносных сосудов, доставка которых в организм при помощи методов генной терапии, могла бы привести к лечебной неоваскуляризации. У большинства ангиогенных факторов уже исследуется механизм действия и эффективность индукции роста новых кровеносных сосудов. В нашем

9

исследовании мы использовали ген фактора роста эндотелия сосудов (VEGF12i) и ген ангиогенина (ANG) .

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью настоящей работы являлось получение рекомбинантных аденовирусов CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов, и исследование возможности индукции неоваскуляризации в результате внутримышечного введения вирусов CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG лабораторным животным.

В связи с этим, в процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Создание векторов на основе аденовируса птиц CELO, несущих гены ANG и VEGF, методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток LMH.

2. Создание вектора на основе аденовируса человека 5, несущего ген ANG, методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток 293,

3. Изучение действия VEGF и ANG, экспрессируемых с генов в составе рекомбинантных аденовирусов, на ангиогенез в мышечной ткани конечностей лабораторных животных.

4. Разработка системы проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, при помощи трансфекции хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов.

5. Исследование антимикробной активности ангиогенина.

10

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩТУ.

1. Созданы рекомбинантные вирусы на основе аденовируса человека типа 5 и на основе аденовируса птиц CELO, несущие гены факторов роста кровеносных сосудов (VEGFm и ANG) .

2. Показано, что созданные нами рекомбинантные аденовирусы индуцируют прирост кровеносных сосудов в мышечной ткани конечностей лабораторных животных.

3. Отработана система проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, при помощи трансфекции хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов.

4. Показано, что ANG не проявляет специфической антимикробной активности.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Нами впервые были получены рекомбинантные аденовирусы CELO-ANG, CELO- VEGF и Ad-ANG, несущие гены факторов роста кровеносных сосудов.

Была продемонстрирована экспрессия генов ANG и VEGF в составе рекомбинантных аденовирусов.

Для проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, нами была разработана тест-система на основе трансфекции хорио-аллантоисной мембраны куриных эмбрионов рекомбинантными плазмидами.

Была продемонстрирована возможность индукции неоваскуляризации в мышцах крыс после введения им

11

рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов.

Нами проведено исследование антимикробной активности ангиогенина, в ходе которого показано, что ANG не обладает антимикробной активностью.

Работа представляет не только научный, но и практический интерес. Нами показано, что аденовирусные векторы, в том числе и векторы на основе Ad птиц CELO, осуществляют эффективный перенос терапевтических генов в мышечные клетки и могут быть использованы в генной терапии ишемических заболеваний. Можно ожидать, что векторная конструкция на основе ДНК аденовируса птиц CELO после соответствующей модификации (инактивирования области GAM-1) окажется эффективной для использования в медицине, в частности в терапии ишимизированных конечностей у человека.
Список литературы
Цена, в рублях:

(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)		 1425
Скачать бесплатно 23249.doc 





Найти готовую работу


ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:


Связаться

Доставка любой диссертации из России и Украины

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ


Ссылки:

Выполнение и продажа диссертаций, бесплатный каталог статей и авторефератов

Счетчики:

Besucherzahler
счетчик посещений

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.