Бесплатно скачать, заказать диплом, курсовую, диссертацию Гиперметилирование ДНК в опунолян человека

У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ

Сделать закладку на сайт

Заказать диплом, курсовую, диссертацию

Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Книга жалоб
и предложений

Название	Гиперметилирование ДНК в опунолян человека

Количество страниц	92

ВУЗ	МГИУ

Год сдачи	2010

Бесплатно Скачать	23370.doc

Содержание	Содержание Оглавление 1-3 Введение 4-5 Глава 1. Обзор литературы "Маркеры метилирования ДНК в опухолях человека" 1.1. Введение 6-7 1.2. Сигнальные пути, нарушаемые в опухолевых клетках вследствие инактивации генов гиперметилированием промоторов 7-17 1.3. Профиль гиперметилированных генов в опухолях 17-22 1.4. Методы определения статуса метилирования CpG-динуклеотидов в ДНК 22-24 1.5. Использование маркеров метилирования ДНК в клинической практике 24-27 Глава 2. Материалы и методы исследования- 28-42 2.1. Список использованных реактивов 28-29 2.2. Клинические материалы 30 2.3. Клеточные линии 30 2.4. Обработка клеточных линий деметилирующим агентом 30 2.5. Выделение ДНК 31-32 2.5.1. Одновременное выделение ДНК и РНК 31 2.5.2. Выделение ДНК из лейкоцитов 31-32 2.6. Выделение плазмидной ДНК 32 2.6.1. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса 32 2.6.2. Выделение плазмидной ДНК на колонках 32 2.7. Обработка ДНК рестриктазами 33 2.8. Бисульфитная конверсия ДНК 33-34 2.8.1. Бисульфитная конверсия ДНК в растворе 33-34 2.8.2. Бисульфитная конверсия ДНК в агарозных бусах 34 2.9. Полимеразная цепная реакция 34-37 2.9.1. Праймеры • 35 2.9.2. Метилчувствительная ПЦР 36 2.9.3. Метилспецифическая ПЦР 36-37 2.10. Определение нуклеотидной последовательности ДНК после бисульфитной конверсии 37 2.10.1. Препаративное получение продукта ПЦР 37-38 2.10.2. Электрофорез продуктов ПЦР в агарозных гелях 38 2.10.3. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля 38-39 2.10.3.1. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля на колонках 38 2.10.3.2. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля на DEAE-целлюлозе 38-39 2.11. Клонирование продуктов ПЦР 39-40 2.11.1. Описание плазмид, использованных в работе в качестве вектора 39 2.11.2. Получение компетентных клеток Escherichia coli 39-40 2.11.3. Трансформация клеток Escherichia coli 40 2.12. Блот-гибридизация 40 2.12.1. Получение препаратов ДНК, меченных Р32 40-41 2.13. Реакция обратной транскрипции 41-42 Глава 3. Результаты: 43-62 3.1. Анализ метилирования CpG-островка гена RAR-p2 в опухолях шейки матки 43-3.2. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 в опухолях шейки матки 50- 3.2.1. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом блот гибридизации по Саузерну 50-52 3.2.2. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом МЧ ПЦР 52-56 3.2.3. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом секвенирования ДНК после бисульфитной конверсии 57-59 3.2.4. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом МС ПЦР 59-61 3.2.5. Влияние деметилирующих агентов на экспрессию TIMP-2 61-63 3.2.6. Сравнение частоты метилирования генов TIMP-2 и ТШР-З в опухолях шейки матки 63 3.3. Определение статуса метилирования TIMP-2 в опухолях молочной железы 63-65 3.4. Профиль метилирования генов в опухолях шейки матки 65-69 Глава 4. Обсуждение 70-75 Выводы 76 Список литературы 77-92 ВВЕДЕНИЕ В качестве объекта исследования в работе использовали одну из наиболее распространенных форм опухолей - рак шейки матки. По частоте заболеваемости, и смертности рак шейки матки занимает второе место, после рака молочной железы, среди всех форм опухолей у женщин. Этиологическим фактором рака шейки матки признаны вирусы папиллом человека (HPV) из так называемой группы «высокого риска» (HPV 16, 18 и родственные им, WHO, Press Release, 1996). Период от начала инфекции до возникновения опухоли может занимать несколько лет. В этот период возникают и накапливаются нарушения в функционировании клеточных генов, регулирующих такие важные для нормальной жизнедеятельности клетки процессы, как пролиферация, апоптоз, ангиогенез, поддержание генетической стабильности. Нарушение функций клеточных генов может происходить как вследствие генетических событий (мутаций), так и вследствие эпигенетических изменений (наследуемых при делении клетки изменений, не связанных с изменением последовательности ДНК). К эпигенетическим .изменениям, часто наблюдаемым в опухолях всех типов, относятся нарушения паттерна метилирования ДНК. Гиперметилированию в опухолевых клетках подвергаются специфические последовательности - CpG-островки, ассоциированные с 5' регуляторными районами многих генов. В нормальных клетках они, как правило, не метилированы. Метилирование промоторов и первых экзонов генов сопровождается подавлением их транскрипции. Таким образом, гиперметилирование 5' регуляторных районов приводит к таким же последствиям для функций генов, как и инактивирующие мутации. Исследования последних лет показали, что опухоли разных типов отличаются по набору генов, инактивируемых вследствие гиперметилирования. В связи с этим необходимо выявление маркеров аберрантного метилирования для каждого типа опухолей. Выявление генов - потенциальных маркеров аберрантного метилирования кардинальным образом расширяет список генов, вовлеченных в канцерогенез, что в свою очередь расширяет возможности для молекулярного подхода к диагностированию, мониторингу и прогнозированию течения заболевания. Цель настоящей работы: идентификация генов, инактивированных в опухолях шейки матки, вследствие гиперметилирования промоторов. Исходя из цели работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1) Определить частоту метилирования в опухолях шейки матки гена рецептора ретиноевой кислоты RARJ3-2; 2) Выяснить, связано ли наблюдаемое в опухолях шейки матки подавление экспрессии гена ТШР-2 (тканевой ингибитор металлопротеиназ 2) с метилированием 5'области гена; 3) В случае обнаружения метилирования определить район 5' области гена TIMP-2, метилирование которого коррелирует с подавлением транскрипции; 4) Определить частоту метилирования гена TIMP-2 в опухолях шейки матки; 5) Определить частоту метилирования гена TIMP-2 в другой форме эпителиальных опухолей — раке молочной железы. Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ МАРКЕРЫ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК В ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА. 1.1. Введение Метилирование ДНК - это процесс энзиматического присоединения метильной группы к основаниям в составе ДНК. Эта модификация ДНК не изменяет генетического кода, однако, как, оказалось, заключает в себе дополнительную информацию, которая существенным образом может влиять на фенотип клетки. Метилирование ДНК осуществляется ферментами - ДНК-метилтрансферазами. Основной последовательностью, которую могут узнавать и метилировать ферменты метилирования, является 5*-СрО-3'динуклеотид (Robertson et al, 2000). CpG-динуклеотиды распределены по геному неравномерно. В геноме существуют короткие (от 500 до 3000 п.н.) последовательности, где CpG-динуклеотиды распределены кластерами, плотность их близка к расчетной, а содержание C+G превышает 60%. Такие последовательности получили название CpG-островков (Bird, 1986). В остальной части ДНК CpG-динуклеотиды распределены равномерно и редко. Большая часть CpG-островков расположена в 5%-регуляторных районах генов, но они встречаются и в интронах, а также на З'-концах генов. Большая часть CpG-островков в отличие от одиночных CpG-динуклеотидов не метилированы в нормальных клетках. Однако из этого правила есть исключения, небольшая часть CpG-островков метилирована в нормальных клетках. В тех случаях, когда наблюдается плотное метилирование (гиперметилирование) CpG-островков, оно сопровождается образованием компактной структуры хроматина в этом участке и подавлением транскрипции соответствующего гена. Таким образом, метилирование CpG-островков ограничивает транскрипционный потенциал генома (Bird, 2002). Гиперметилирование промоторных районов генов в нормальных клетках выполняет специфические функции, связанные с аллель-специфической экспрессией генов (импринтинг, инактивация хромосомы X), с подавлением экспрессии некоторых тканеспецифических генов, а также транспозонов (Li, 2002; Walsh et al, 1998; Futscher et al, 2002). Гиперметилирование некоторых генов, обычно неметилированных, наблюдается также в нормальных клетках при старении (Issa et al, 1994; Ahuja et al, 1998). Нарушение закономерностей метилирования в клетках взрослого организма наблюдается при некоторых заболеваниях человека, в том числе в злокачественных новообразованиях (Robertson et al, 2000; Jones et al, 2002). Во многих исследованных неопластических клетках наблюдается дисбаланс метилирования (рис. 1). Он выражается в широко распространенном по геному деметилировании нормально метилированных CpG-сайтов, с одной стороны, и локальном гиперметилировании CpG-островков ДНК, с другой. В обзоре будет рассмотрен только один из наблюдаемых в опухолевых клетках типов нарушений метилирования, а именно гиперметилирование CpG-островков, ассоциированных с 5'регуляторными районами генов. Поскольку CpG-островки, ассоциированные с 5'районами генов, в большинстве своем не метилированы в нормальных тканях, то для них применимы термины - гиперметилирование, аберрантное метилирвание или просто метилирование. 1.2. Сигнальные пути, нарушаемые в опухолевых клетках вследствие инактивации генов гиперметилированием промоторов. До недавнего времени подавляющее число исследований метилирования CpG-островков в опухолях относилось к уже известным генам. Во многих типах опухолей была обнаружена инактивация путем аберрантного метилирования CpG-островков известных генов-супрессоров опухолевого роста и метастазирования, генов системы репарации ДНК и генов, вовлеченных в регуляцию апоптоза и ангиогенеза. В таблице 1 приведены основные сигнальные пути, которые, как известно, часто нарушаются в опухолевых клетках. Эти сигнальные пути были выявлены благодаря исследованиям генетических механизмов нарушения функций генов, вовлеченных в канцерогенез. Оказалось, что многие гены-участники этих сигнальных путей могут быть инактивированы с помощью альтернативного мутациям механизма — метилирования 5'регуляторного района. В таблице 1 приведены примеры таких генов. Ген ретинорбластомы (Rb)- первый классический ген-супрессор, для которого было обнаружено метилирование его промотора в опухолях. Предполагается, что почти все антипролиферативные сигналы реализуются в клетке опосредовано через белок pRb или родственные ему белки р107 и р130 (Hanahan et al, 2000). Примерно в 10-15% случаев спорадической (односторонней) ретинобластомы имеет место гиперметилирование CpG-островка промотора гена Rb. Эпигенетический механизм инактивации Rb имеет место только при этой форме опухоли. В большинстве остальных случаев (а инактивация Rb отмечена при многих формах рака) механизм иной - мутации и делеции гена, что подтверждает одинаковый функциональный итог этих изменений (Greger et al, 1989). Сигнальный путь Гены Регуляция клеточного цикла Rb, INK4A, FHIT Регуляция апоптоза PTEN, DAP-киназа, TIMP-3 Регуляция ангиогенеза THBS1, VHL, T1MP-3 Репарация повреждений ДНК и защита от повреждений ДНК hMLH-1, MGMT, GST-Ti Регуляция адгезивных взаимодействий, подвижности и протеолитической активности клеток E-KadxepuHiCDHl), TIMP-3 Ответ на факторы, регулирующие рост и дифференцировку RAR/3-2, SOCS INK4A Ген INK4A кодирует конститутивно экспрессируемый ингибитор циклин-зависимых киназ. Белок р16Ш1С4А играет ключевую роль в контроле клеточного цикла. Связываясь с циклин-зависимыми киназами CDK4 и CDK6, pl6[NIC4A блокирует сигнальный путь cyclin D-Rb. Утрата этого белка или его инактивация приводит к нарушению клеточного цикла. Циклин-зависимые киназы фосфорилирует pRb, в результате чего из неактивного комплекса с Rb высвобождается фактор транскрипции E2F. В итоге активируются гены, обусловливающие вхождение клетки в фазу S цикла. Функциональная потеря pl6INK4A часто имеет место в различных первичных опухолях и производных клеточных линиях вследствие потери гетерозиготности и соматической мутации оставшегося аллеля или гомозиготных делеций (Nobori et al, 1994). Было показано, что часто потеря экспрессии гена INK4A в отсутствие делеций коррелирует с гиперметилированием CpG-островка в 5'-области гена. Метилирование гена INK4A составляет, по разным данным, от 20 до 67 % в опухолях человека разной локализации: в глиомах, в опухолях мочевого пузыря, молочной железы, толстого кишечника, пищевода, головы и шеи, легкого, ротоглотки, яичника и других (Baylin et al, 1998). Метилирование INK4A наблюдается в предопухолевых поражениях бронхов, легкого, желудка, что указывает на то, что оно является ранним и важным событием в канцерогенезе. Было показано также, что метилирование INK4A в нормальной ткани легкого ассоциировано с курением, что рассматривается как фактор риска развития заболевания (Kim et al, 2001; Lamy et al, 2002; Jang et al, 2001). FHIT FH1T- (fragile histidine triad) - белковый продукт гена - АРЗА гидролаза, которая расщепляет субстрат АР4А; АР4-молекула, которая вовлечена в контроль клеточного цикла и репликации ДНК. FHIT - предполагаемый негативный регулятор клеточного цикла. Отсутствие или снижение уровня мРНК, а также неполноразмерные транскрипты этого гена обнаружены во многих типах опухолей, в том числе при раке шейки матки. Мутации, аллельные и гомозиготные делеции гена FHIT были показаны в нескольких типах опухолей (Zou et al, 1997; Negrini et al, 1996; Gemma et al, 1997; Thiagalingam et al, 1996). Метилирование 5'CpG-островка FHIT, сопровождающееся инактивацией транскрипции, наблюдается в различных типах опухолей: опухолях мочевого пузыря, шейки матки, пищевода, легкого, молочной железы, простаты, ротовой полости, яичка (Maruyama et al, 2001; Wu et al, 2003; Kuroki et al, 2003; Zochbauer-Muller et al, 2001; Maruyama et al, 2002; Chang et al, 2002; Honorio et al,2003). DAPK DAPK (от англ death-associated protein kinase) - ген киназы белков, ассоциированных с апоптозом. Продукт гена - регулятор апоптоза, индуцируемого у-интерфероном (IFN-y), TNF-a, активацией Fas рецептора или утратой контакта с экстрацеллюлярным матриксом. (Cohen et al, 2001) Во многих клеточных линиях белок и мРНК DAP киназы часто отсутствуют. Во многих опухолях наблюдается метилирование промотора гена, сопровождающееся подавлением транскрипции. Метилирование промотора гена DAPK было обнаружено при множественной миеломе, в опухолях легкого, мочевого пузыря, головы и шеи, носоглотки (Margaret et al, 2001; Kim et al, 2001; Tada et al, 2002; Hasegawa et al, 2002; Wong et al, 2002). PTEN PTEN (MMAC1) - ген кодирует протеин/липидную фосфатазу. Продукт гена индуцирует апоптоз, подавляя активность Р[ЗК-РКВ/Ак] сигнального пути. Возможно, продукт PTEN вовлечен также в регуляцию клеточной адгезии, миграции и дифференцировки (Tamura et al, 1998). Многие опухоли характеризуются мутациями PTEN и аллельной потерей большого хромосомального района, в котором картирован ген PTEN (10q23). Полная утрата функций Pten ассоциирована с поздними стадиями прогрессии опухолей и метастазированием (Li et al, 1997; Steck et al, 1997; Cairns et al, 1997). Метилирование промотора гена обнаружено во многих типах опухолей: глиобластомах, гепатокарциномах, опухолях легкого, желудка, матки (Baeza et al, 2003; Schagdarsurengin et al, 2003; Soria et al, 2002; Kang et al, 2002; Salvesen et al, 2001). TIMP-3 Ген TIMP-3 (tissue inhibitor of metalloproteinase-3) - тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ 3, относится к семейству ингибиторов матриксных металлопротеиназ (ММР), включающему еще 3 гена: TIMP-1, TIMP-2 и TIMP-4. Продукты этих генов играют ключевую роль в поддержании гомеостаза экстрацеллюлярного матрикса за счет регуляции активности ММР. ММР играют активную роль в инвазии и метастазировании опухолей: их повышенная экспрессия и активность ассоциированы со злокачественными превращениями опухолевых клеток. Снижение экспрессии TIMP может также приводить к увеличению активности ММР и увеличению злокачественного потенциала опухолевых клеток (Jiang et al, 2002; Seo et al, 2003). Ингибирующая способность генов семейства Т1МР> таким образом, играет важную роль на поздних стадиях прогрессии опухоли. Однако гены семейства TIMP — полифункциональные белки, и помимо их способности ингибировать различные ММР, они обладают и другими функциями, по которым члены семейства отличаются друг от друга. Они по-разному влияют на клеточную пролиферацию, апоптоз и ангиогенез, таким образом, оказывая влияние на выживаемость опухолевх клеток и ранние этапы становления опухоли (Jiang et al, 2002). Эти эффекты могут проявляться через ММР-зависимый и независимый пути. TIMP-3 - единственный из всех членов семейства обладает проапоптотическими свойствами. Он способен индуцировать апоптоз при экзогенной экспрессии в опухолевых клетках, а также подавлять рост, инвазию и ангиогенез в первичных опухолях (Ahonen et al, 1998; Anand-Apte et al, 1996; Bian et al, 1996). Метилирование промотора TIMP-3, сопровождающееся подавлением транскрипции гена, было показано для клеток опухолей толстого кишечника и желудка в культуре, затем для первичных опухолей почки и мозга, где метилирование гена сопровождалось подавлением экспрессии белка (Bachman et al, 1999; Kang et al, 2000). TIMP-3 часто метилирован также в опухолях легкого, поджелудочной железы, желудка и нейрофибромах (Zochbauer-Muller et al, 2001; Wild et al, 2003; Kang et al, 2003; Gonzalez-Gomez et al, 2003). В некоторых случаях метилирование TIMP-3 было обнаружено в предраковых новообразованиях, и частота метилирования гена возрастала с прогрессией от предраковых новообразований к карциномам желудка (Kang et al, 2001). Частота метилирования гена коррелировала с метастазированием в опухолях поджелудочной железы (Wild et al, 2003). THBS1 THBS1 (thrombospondin-1) - ген, который кодирует ингибитор ангиогенеза тромбоспондин 1. Экспрессируется во многих тканях и регулируется продуктами генов р53и Rb. Thbsl ингибирует адгезию, рост и подвижность клеток эндотелия сосудов в ответ на ангиогенные стимулы. Снижение экспрессии THBSI отмечено во многих опухолях, а его реэкспрессия в клетках рака молочной железы замедляет рост опухоли, ангиогенез и метастазирование. До сих пор не обнаружено мутаций, делеций или транслокаций этого гена в опухолях человека. Метилирование CpG-островка и сопряженная с этим инактивация THBS1 отмечена в глиомах и нейробластоме (Li et al, 1999; Yang etal, 2003). MGMT MGMT- (от англ. O6-methy]guanine-DNA methyltransfrase) - продукт гена MGMT-фермент, который репарирует ДНК, удаляя метальные и алкильные радикалы из 0-6 позиции гуанина в ДНК. Об-метилгуанин способен образовывать водородные связи с тимином, что приводит после репликации ДНК к замене пары Г:Ц на А:Т. О6 -алкилгуанин может образовывать сшивки с цитозином в противоположной цепи ДНК, блокируя репликацию. Удаляя метальные и алкильные аддукты из ДНК, фермент защищает клетки от канцерогенного и цитотоксического действия алкилирующих агентов. Способность клеток противостоять воздействию таких агентов прямо зависит от числа молекул фермента (Pegg AE, 1990). В нормальных клетках при снижении уровня MGMT повышается чувствительность к мутагенному эффекту канцерогенов, равно как и к цитотоксическому. Опухолевые клетки с дефицитом MGMT приобретают еще одно важное свойство - чувствительность к терапии алкилирующими агентами. В опухолях с подавленной экспрессией MGMT, как правило, отсутствуют, как белок, так и мРНК, а делеции и реаранжировки и точечные мутации гена встречаются крайне редко, что указывает на эпигенетическую природу подавления экспрессии (Pieper et al, 1990). Действительно, метилирование промотора в опухолях со сниженной экспрессией MGMT было обнаружено в значительном проценте случаев при раке легкого, толстого кишечника, печени, желудка, в опухолях головы и шеи, в глиомах и лимфомах (Costello et al, 1994; Esteller et al, 1999; Zhang et al, 2002; Oue et al, 2001). hMLH1 hMLHl - продукт этого гена участвует в репарации неспаренных оснований, возникающих как следствие ошибок репликации ДНК. Его мутации обнаруживают у больных наследственным неполипозным раком толстой и прямой кишки, а также спорадической формой рака этой локализации. Инактивация hMLHl ведет к накоплению мутаций в коротких повторяющихся (микросателлитных) последовательностях. Потеря функциональной активности этого гена часто вызвана метилированием его CpG-островка (Strathdee et al,1999). Было установлено, что микросателлитная нестабильность при спорадической форме рака толстого кишечника, эндометрия и желудка в большинстве случаев обусловлена именно этой причиной (Herman JG, 1999). GST-7i{GSTP1) Глютатион-S- трансфераза-л относится к семейству глютатион-S- трансфераз -ферментов, которые защищают клетки от повреждений ДНК электрофильными канцерогенами, катализируя их конъюгацию с глютатионом. Ген глютатион-S-трансферазы-тс метилирован и его транскрипция угнетена практически во всех исследованных случаях первичного рака предстательной железы, где он является наиболее постоянным маркером (Lee et al, 1994). Метилирование GST-л обнаружено также при раке молочной железы, почек, печени (Zhong et al, 2002). Е-кадхерин [CDH1) Е-кадхерин (CDH1) — член семейства генов трансмембранных гликопротеинов, белковый продукт гена участвует в межклеточных контактах, инициирует передачу сигналов, активирующих р53 и р27 ^'(негативный регулятор клеточного цикла). Ассоциация рядом расположенных эпителиальных клеток посредством мостика из молекул Е-кадхерина инициирует антиростовой сигнал. Е-кадхерин рассматривается как супрессор инвазии и метастазирования в карциномах. Мутации гена в половых клетках наблюдается при наследственных формах рака желудка, а также при спорадических формах рака желудка и др. Снижение экспрессии Е-кадхерина коррелирует с приобретением инвазивного фенотипа клетками рака различных органов человека(Ровенский,1998). Во многих опухолях человека наблюдается метилирование Е-кадхерииа: опухоли простаты, молочной железы, щитовидной железы, почки, печени, шейки матки, ротовой полости (Kanai et al, 1997; Graff et al, 1998; Viswanathan et al, 2003; Graff et al, 1995; Chang et al, 2003; Chen et al, 2003). SOCS SOCS (от англ. the suppressor of cytokine signaling - супрессор сигнальных путей, активируемых цитокинами) - ингибитор сигнального пути JAK/STAT (JAK - Janus kinase; STAT - signal transducers and activators of transcription), потенциальный опухолевый супрессор. Этот сигнальный путь играет важную роль в регуляции клеточного роста, дифференцировки и гематопоэза. Нарушение JAK/STAT пути наблюдается во многих опухолевых клетках. Семейство SOCS включает 8 белков, которые ингибируют JAK/STAT сигнальный путь с помощью разных механизмов. На модельных системах было показано, что восстановление транскрипции SOCS-3 приводило к подавлению активности STAT3, индукции апоптоза и подавлению роста клеток. Для двух членов семейства (SOCS-1, SOCS-3) показано, что подавление экспрессии в опухолевых клетках коррелирует с метилированием их промоторов. Метилирование промоторов обнаружено в опухолях печени, опухолях легкого, множественных миеломах (Okochi et al, 2003; Galm et al, 2003; Nagai et al, 2003). SOCS-3, как было обнаружено недавно, метилирован в клеточных линиях опухолей легкого, молочной железы, мезотелиомы (Не et al, 2003). Таким образом, подавление транскрипции SOCS-3 за счет метилирования его промотора является одним из важных механизмов активации JAK/STAT пути в патогенезе опухоли. RAR/3-2 Ген RARJ3 относятся к суперсемейству ядерных рецепторов, являющихся лиганд-активируемыми транскрипционными факторами (Chambon, 1994). Лигандами для рецепторов класса RAR (от англ. retinoic acid receptor) являются ретиноиды - витамин А и его биологически активные метаболиты. Известно, что ретиноиды способны ингибировать пролиферацию клеток и индуцировать клеточную дифференцировку. В связи с этим их используют для терапии и предотвращения развития различных опухолей (Hong et al, 1994; Behbakht et al, 1996). Класс рецепторов RARp включает три субтипа RARa, RARP и RARy. При действии лиганда рецепторы класса RAR образуют гетеродимерные комплексы с RXRs (ретиноидные рецепторы класса X). Эти комплексы активируют транскрипцию за счет связывания с ретиноид-респонсивными элементами (RAREs), локализованными в промоторных участках генов-мишений (Chambon, 1994). Одной из мишеней для ретиноидных рецепторов является сам ген RARp. Ген RARp кодирует четыре транскрипта и экспрессируется в нормальных эпителиальных тканях, где его экспрессия может увеличиваться в ответ на обработку ретиноевой кислотой (RA) (de The et al, 1989; de The et al, 1990). Было обнаружено, что во многих клеточных линиях, полученных из различных опухолей человека, уровень мРНК гена RARp-2 (одного из четырех транскриптов этого гена) снижен или вообще не определяется: клеточные линии рака легкого, эпителиального рака яичников, рака молочной железы, рака простаты, рака желудка, рака шейки матки (Nervi et al, 1991; Virmani et al, 2001; Swisshelm et al, 1994; Caliaro et al, 1994; Yang et al, 2002; Bovenzi et al, 2001; Sirchia et al, 2000; Yang et al, 2001; Nakayama et al, 2001; Yamanaka et al, 2003; Hayashi et al, 2001; Xu etal, 1999). Снижение уровня мРНК гена RAR/3-2 (по сравнению с нормальными тканями) было обнаружено также в первичных опухолях шейки матки, молочной железы (Comerci et al, 1997), в опухолях головы и шеи (Xu et al, 1994; Lotan et al, 1995), легкого, желудка и предзлокачественных поражениях ротовой полости (Lotan et al, 1995; McGregor et al, 2002). Все эти факты указывают на то, что специфическое снижение экспрессии RARJ3-2 может быть важным событием в канцерогенезе. В пользу этого предположения говорят эксперименты с клеточными культурами, где было показано, что RAR/i-2 может функционировать как опухолевый супрессор. Экзогенная экспрессия гена RARfi-2 в различных опухолевых линиях клеток, негативных по RAR.p-2, подавляет их рост при обработке ретиноевой кислотой. Постоянная экспрессия антисенс-РНК RAR/3 в клетках карцином, экспрессирующих RAR(3 снижает чувствительность к ингибирующему рост эффекту ретиноевой кислоты (Sun et al, 2000). Подавление роста клеток при экзогенной экспрессии RAR/3-2 сопровождается остановкой клеточного цикла в G1 фазе и индукцией апоптоза (Seewaldt et al, 1995; Liu et al, 1996). Таким образом, дефицит экспрессии RARJ3-2 помогает опухолевой клетке избежать контроля за ростом, индуцируемомого ретиноевой кислотой. Механизм подавления экспрессии RAR.p-2 в опухолевых клетках до сих пор окончательно не выяснен, однако в последнее время появились доказательства того, что одним из механизмов инактивации гена является метилирование его промотора. Хорошо известно, что не во всех Л4/?/?-2-негативных клеточных линиях карцином удается индуцировать его экспрессию при обработке ретиноевой кислотой (Yang et al, 2002). В одной из таких клеточных линий, полученной из карциномы толстого кишечника, удалось восстановить индукцию RAR/3-2 под действием ретиноевой кислоты после предварительной обработки клеток деметилирующим агентом - 5-аза-2'-дезоксицитидином, что наводило на мысль о метилирование его промотора в этих клетках (Cote et al, 1998). Действительно, метилирование промотора и 1 экзона RAR/3-2, сопровождающееся подавлением транскрипции гена, было затем показано для клеточных линий, полученных из карцином молочной железы, толстой кишки, желудка, пищевода, простаты, легкого, шейки матки (Widschwendter et al, 2001; Cote et al, 1998; Hayashi et al, 2001; Kuroki et al, 2003; Nakayama et al, 2001; Virmani et al, 2000; Virmani et al, 2001). Метиллирование промотора RAR/3-2 оказалось частым событием также во многих первичных опухолях человека: опухолях легкого, желудка, простаты, поджелудочной железы, пищевода, двенадцатиперстной кишки, молочной железы,

Список литературы

Цена, в рублях: (при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)	1425

Скачать бесплатно	23370.doc

Найти готовую работу

ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:

Связаться

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ

15.04.24 Задачи, условия и этапы организации экспериментальной работы

15.04.24 Критерии качества преподавания

15.04.24 Категория нормы в обучающей деятельности

Архив материала для курсовых и дипломных работ

Ссылки:

Счетчики:

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.