Бесплатно скачать, заказать диплом, курсовую, диссертацию Т—лимфоциты в восстановлении воспроизводительной функции у коров после отела

У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ

Сделать закладку на сайт

Заказать диплом, курсовую, диссертацию

Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Книга жалоб
и предложений

Название	Т—лимфоциты в восстановлении воспроизводительной функции у коров после отела

Количество страниц	89

ВУЗ	МГИУ

Год сдачи	2010

Бесплатно Скачать	24756.doc

Содержание	Содержание ОГЛАВЛЕНИЕ Список сокращений...4 Введение...6 1. Обзор литературы...13 1.1. Функции и маркеры Т-лимфоцитов...13 1.1.1. Иммунологическая толерантность к аутологичным антигенам...13 1.1.2. ct/p CD2+Т-лимфоциты в иммунобиологическом надзоре организма...15 1.1.3. y/SCD2+ Т-клетки и их роль в иммунобиологическом надзоре...25 1.1.4. Уникальная субпопуляция у/5 WC1 CD2 Т-лимфоцитов крупного рогатого скота...29 1.2. Иммунные факторы в этиологии и патогенезе хронических эндометритов у крупного рогатого скота...31 1.2.1. Иммунодепрессия в возникновении и развитии эндометрита у коров...31 1.2.2. Клеточный иммунитет в этиологии и патогенезе эндометритов у коров. 34 1.3. Заключение по обзору литературы...38 2. Материалы и методы...41 2.1. Выделение лимфоцитов и макрофагов...41 2. 2. Изучение прямой антимикробной активности Т-лимфоцитов крупного рогатого скота...49 2.3. Определение влияния стимуляции эндогенного синтеза бактерицидных Т-лимфокинов на восстановление репродуктивной функции у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом...50 3. Результаты исследований...53 3.1. Изучение in vitro у крупного рогатого скота Т-клеточного иммунитета по отношению к штаммам условнопатогенной микрофлоры...53 3.1.1. Прямое бактерицидное действие Т-клеток крупного рогатого скота по отношению к штаммам синегнойной палочки...53 3 3.1.2. Определение специфичности антимикробного Т-клеточного иммунитета по отношению к штаммам условнопатогенной микрофлоры...61 3.2. Клеточный иммунитет у клинически здоровых коров и коров с хроническим эндометритом...64 3.3. Влияние инактивированной суспензии синегнойной палочки на восстановление воспроизводительной функции у коров с хроническим эндометритом...66 3.4. Изменение клеточного иммунитета у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом до и после обработки инактивированной суспензией штаммов Ps. aeruginosa...71 4. Обсуждение результатов...74 Выводы...86 Практические предложения...88 Литература...89 А-клетка (АПК) АКТГ ГМ-КСФ Е-РОК ЕАС-РОК ИЛ иссп ИФ Кон А ЛПС МПА НК нрТ ПГЕ гаг Рв рт тиссп т- ТКР ТФР ФГА ФИО Эк ИССП цтл CD (Clauster Designation) Введение Список сокращений - антигенпрезентирующая клетка - адренокортикотропный гормон - гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор - лимфоцит, образующий спонтанные розетки с эритроциами барана лимфоцит, имеющий рецепторы к фрагментам комплемента - интерлейкин - инактивированная суспензия синегнойной палочки - интерферон - конкавалин А - липополисахарид - мясопептонный агар - нормальные киллерные клетки - неренсибилизированные Т-лимфоциты - простагландин Е - простагландин F - ресенсибилизированные В-лимфоциты - ресенсибилизированные Т-лимфоциты - термоинактивированная суспензия синегнойной палочки - Т-лимфоцит - Т-клеточный рецептор - трансформирующий фактор роста - фитогемагглютинин - фактор некроза опухолей - экторицид-инактивированная суспензия синегнойной палочки - цитотоксический Т-лимфоцит - маркерная молекула лейкоцитов в- HSP ICAM L LFA MHC R Th Thy mlg slg Б-лимфоцит белоки теплового шока (шаперон) молекулы межклеточной адгезии лиганд мембранные лейкоцитарные молекулы, опосредующие антиген неспецифическую межклеточную адгезию лейкоцитов главный комплекс гистосовместимости рецептор Т-хелпер специфический антиген Т-лимфоцитов крупного рогатого скот; мембранный иммуноглобулин растворимый иммуноглобулин Введение Актуальность темы. Увеличение продуктивности в молочном скотоводстве в значительной степени зависит от сокращения времени от отела до плодотворного осеменения. Это удлинение сервис-периода часто обусловлено возникновением у коров в послеотельный период воспалительных процессов в половых путях. В этой форме нарушения репродуктивной функции значительный удельный вес принадлежит хроническим гнойно-катаральным эндометритам (8,99). Несмотря на многообразие экзо- и эндогенных факторов, вызывающих увеличение сервис-периода у крупного рогатого скота, непосредственной их причиной, является угнетение иммунной системы и в первую очередь местного иммунитета тканей половых путей. Подавление активности лимфоидной ткани матки снижает ее репаративную регенерацию и способствует колонизации ее условнопатогенной микрофлорой. Данная микрофлора, синтезируя факторы патогенности (эндо-, экзотоксины и др.), усиливает эту иммунодепрессию (29, 190). В настоящее время существует большое количество способов ликвидации воспаления и восстановления воспроизводительной функции у коров с хроническими гнойно-катаральными эндометритами. Большинство этих способов основано на применении антимикробных препаратов. Существенным недостатком их является высокая устойчивость к ним штаммов условнопатогенных микроорганизмов, а также их иммунодепрессивное действие (68, 84). В связи с этим наиболее перспективным направлением в профилактике и ликвидации эндометритов у коров считают разработку способов восстановления активности местного иммунитета тканей матки (79, 106). Известно, что Т-лимфоциты осуществляют важную роль в регуляции практически всех звеньев иммунитета. В частности, они сами синтезируют и регулируют синтез другими клетками про- и противовоспалительных цитокинов. Соотношение этих цитокинов определяет направленность обменных процессов в клетках, их устойчивость к действию апоптогенных факторов и многие другие физиологические функции в организме, оказывающие непосредственное влияние на репаративные процессы в тканях (131,168,174). Недавно было показано, что Т-лимфоциты некоторых видов млекопитающих оказывают антимикробное действие к Ps. aeruginosa (внеклеточный патоген) не только опосредованно через активацию и регуляцию антителогенеза, но и осуществляют прямое бактерицидное действие на штаммы этого микроорганизма. Важной особенностью этого иммунитета является специфичность его индукторного звена и неспецифичность - эффекторного. Так, ресенсибилизирующий штамм Ps. aeruginosa вызывает синтез Т-лимфоцитами бактерицидных факторов к широкому спектру штаммов не только других видов, но даже родов и семейств условнопатогенных микроорганизмов (122, 100). Известно, что липолиполисахарид клеточной стенки синегнойной палочки (как и других грамотрицательных бактерий) является природным иммуномодулятором, способным оказывать существенное влияние на соотношение про- и противовоспалительных цитокинов (63, 181). Соотношение этих про- и противовоспалительных цитокинов определяет не только направленность иммунного ответа, но и интенсивность регенеративных процессов в тканях. Таким образом, иммуномодулирующий препарат на основе инактивированных штаммов Ps. aeruginosa может стимулировать восстановление воспроизводительную функцию у коров после отела (в том числе и у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом) посредством активации местного иммунитета лимфоидной ткани матки, индуцирующего ликвидацию воспаления и стимулирующего репаративные процессы в маточных структурах. Научная новизна. Впервые показано, что у крупного рогатого скота: - Т-лимфоциты обладают прямой бактерицидной активностью по отношению к внеклеточным патогенам, которая усиливается после специфической ресенсибилизации; - эта антимикробная функция Т-клеток возрастает в присутствии макрофагов; - для активации этого вида иммунитета, в отличие от иммунитета к внутриклеточным патогенам, не требуется непосредственного контакта Т-клетки и макрофагов. Он осуществляется синтезом макрофагами ИЛ-1; - индукторное звено прямого антимикробного иммунитета является специфическим, тогда как эффекторное - неспецифично и направлено против широкого спектра внеклеточных патогенов; - цитотоксическое проявление этого вида иммунитета, в отличие от иммунитета к внутриклеточным патогенам, не требует обязательного контакта Т-лимфоцита и клетки-мишени, а опосредуется синтезом Т-клетками растворимых бактерицидных факторов; - Т-лимфоциты способны оказывать прямое антимикробное действие на большинство условнопатогенных микроорганизмов, в том числе и Act. pyogenes, нередко обнаруживаемых в патологическом материале, полученном от коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом; - у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, по сравнению со здоровыми коровами, отмечена тенденция снижения прямой бактерицидной активности Т-лимфоцитов периферической крови, а также внутрипопуляционное изменение среди них - снижение общей численности Т-клеток с одновременным увеличением количества Е-РОК; - внутриматочная обработка ИССП, по сравнению с аналогичной обработкой левоэритроциклином коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, оказала сильный противовоспалительный эффект, сильнее активировала репаративную регенерацию матки, повысила результативность от первого осеменения, за 90 суток и значительно укоротила период времени от начала лечения до плодотворного осеменения; - более сильное протективное действие ИССП, по сравнению с левоэритроциклином, было связано с интенсивным изменением у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, местного и отчасти системного соотношения про- и противовоспалительных цитокинов. У коров, обработанных ИССП, в первые сутки после обработки происходило обострение воспалительного процесса, сопровождающееся увеличением выделения из матки гнойных масс, повышением температуры тела, снижением аппетита, суточного удоя, что было обусловлено действием прововоспалительных цитокинов. Стимуляция восстановления маточных структур после ликвидации воспалительного процесса была связана с активностью противовоспалительных цитокинов, индуцирующих анаболитические процессы в организме и обладающих антиапоптогенным действием; - у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, после обработки ИССП, по сравнению с ее началом, отмечено увеличение бактерицидной активности Т-лимфоцитов периферической крови, а также общего их количества, происшедшие, главным образом, за счет возрастания Е-РОК. Цель и задачи исследований. Целью данной работы было определение возможного существования у Т-лимфоцитов крупного рогатого скота прямой антибактериальной активности к внеклеточным патогенам; изучение иммунопротективной роли Т-лимфоцитов в восстановлении репродуктивной функции у коров после отела; а также выяснение возможности сокращения времени восстановления этой функции посредством активации местного иммунитета тканей матки. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 10 Определить возможное существование у Т-лимфоцитов крупного рогатого скота прямой бактерицидной активности по отношению к внеклеточным патогенам. 1. Выяснить роль макрофагов в существовании этой возможной функции у Т-лимфоцитов крупного рогатого скота. 2. Изучить специфичность индукторного и эффекторного звеньев этого возможного вида иммунитета. 3. Определить конкретные механизмы этой возможной Т-клеточной антимикробной активности. 4. Провести сравнительное изучение содержания Т-, В-лимфоцитов, Е-РОК и бактерицидной активности Т-клеток периферической крови здоровых коров и коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом. 5. Выявить возможность коррекции местного иммунитета лимфоидной ткани матки у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, с целью стимуляции его противовоспалительного и репаративного эффекта. 6. Сравнить эффективность обработки ИССП и левоэритроциклином коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, по времени прекращения воспалительного процесса, времени от начала лечения до плодотворного осеменения, а также по числу коров, ставших стельными от первого осеменения и за 90 суток. 7. Изучить численность Т-, В-лимфоцитов, Е-РОК, а также бактерицидную активность Т-клеток периферической крови коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, до и после обработки их ИССП. Практическая значимость работы. Разработан метод определения прямого антимикробного иммунитета Т-лимфоцитов крупного рогатого скота по отношению к внеклеточным патогенам, Данный метод может быть использован в научных исследованиях по изучению этого вида иммунитета в норме и различных патологиях у животных. Создан новый подход в разработке методов иммунодуляции местного иммунитета тканей матки, и проявляющийся в активации антимикробного иммунитета (в том числе и Т-клеточного), а также в усилении репаративной регенерации в этих тканях. Данная разработка может быть использована для дальнейшего совершенствования предложенного подхода иммунокоррекции местного иммунитета лимфоидных тканей матки. Основные положения, выносимые на защиту: Т-лимфоциты крупного рогатого скота, как и других видов млекопитающих, обладают прямой бактерицидной активностью к внеклеточным паразитам. Эта активность усиливается после специфической ресенсибилизации, а также в присутствии макрофагов. Данное стимулирующее действие макрофагов обусловлено синтезом ими ИЛ-1. Индукторное звено прямого антимикробного иммунитета Т-лимфоцитов носит специфический характер, тогда как эффекторное — неспецифично и проявляет бактерицидную активность к широкому спектру внеклеточных патогенов, в том числе и условнопатогенным микроорганизмам, нередко выделяемым из патологического материала, полученного от коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом. Обработка коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, ИССП стимулирует активность местного иммунитета лимфоидных тканей матки, проявляющейся в ликвидации воспалительного процесса и усилении восстановления маточных структур. Главное иммуномодулирующее действие ИССП связано с индукцией ЛПС клеточной стенки Ps. aeruginosa миграции фагоцитарных клеток и лимфоцитов в очаг воспаления и поочередная стимуляция местного и отчасти системного синтеза клетками иммунной системы (в первую очередь Т-лимфоцитами) про- и противовоспалительных цитокинов, обеспечивающих антивоспалительное и репаративное действие в матке. Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на международной научно-практической конференции ФГОУ РАМЖ «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового 12 обеспечения», 2003 и 2004 гг., п. Быково Московской обл.; международной научно-практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки» ВГНИИЖ, п. Дубровицы, 2004 г. Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 7 печатных работах. 13 1. Обзор литературы 1.1. Функции и маркеры Т-лимфоцитов Главная роль Т-клеток в организме - осуществление иммунобиологического надзора, проявляющаяся в поддержании "своего" антигенного состава и элиминации клеток, экспрессирующих "чужеродные" антигены. По структуре антигенраспознающих рецепторов эти лимфоциты подразделяются на а/(3 и у/5-ТКР субпопуляции. 1.1.1. Иммунологическая толерантность к аутологичным антигенам Сохранение "своего" антигенного состава организма происходит главным образом посредством формирования иммунологической толерантности Т-клеток к собственным антигенам организма. В основном этот процесс осуществляется в тимусе. В тимусе, центральном органе иммунной системы, происходит формирование Т-лимфоцитов из клеток предшественников, имеющих еще неперестроенные гены ТКР. В процессе созревания Т-клеток в этом органе осуществляется перестройка данных генов, образование и экспрессия ТКР, способных распознавать инородные антигены в комплексе с аутологичными антигенами I или II классов МНС. Известно, что в процессе онтогенеза формируются аутореактивные клоны Т-лимфоцитов, способные вызывать деструкцию клеток, экспрессирующих аутологичные антигены. В тимусе эти клетки подвергаются делеции — апоптозу (17). Считают, что основной причиной этого физиологического процесса - элиминации аутореактивных тимоцитов является отсутствие костимулирующих факторов, необходимых для активации и пролиферации Т-лимфоцитов (20). В то же время не все аутореактивные Т-клетки подвергаются делеции в тимусе. Небольшая часть этих тимоцитов попадает в периферические отделы иммунной системы, где они подвергаются 14 делеции или формированию у них анергии (20, 141). Функция клеточной анергии - отсутствие пролиферации и образования специфических ЦТЛ, несмотря на наличие антигенной стимуляции, происходит при Т-Т-клеточной презентации антигена в отсутствии профессиональных А-клеток (175, 180) или ghb активации специфических Т-клеток супрессоров (17, 117). В тимусе происходит и делеция клонов тимоцитов, которые не распознают аутологичные молекулы антигенов гистосовместимости а также тимоцитов, у которых произошла неудачная реанжировка генов ТКР или коммитирование CD4+ или CD8+ субпопуляций Т-лимфоцитов, не соответствующее специфичности рецепторов в отношении I или II классов антигенов МЫС (20, 35). Иммунологическая толерантность Т-клеток существует не ко всем аутоантигенам. В так называемых иммунопривилегированных местах организма — семенниках, плаценте и передней камере глаза представлены клетки, экспрессирующие аутоантигены, способные индуцировать образование антигенспецифических клонов ЦТЛ. Этот процесс предотвращается апоптозом аутореактивных Т-лимфоцитов посредством связывания их FAS-рецептора (CD95, АРО-1) с FAS-лигандом (FASL). FAS-молекула относится к суперсемейству рецепторов к ФНО (159). FASL установлен на клетках Сертоли, эпителии передней камеры глаза (75, 173), клетках эндометрия и плаценты (195). Важная роль системы FAS-FASL показана на мышах gld, у которых нарушена функциональная активность FASL вследствие точечной мутации - замены фенилаланина на лейцин. У гомозиготноспаренных самок gld на десятые сутки беременности была обнаружена интенсивная инфильтрация лейкоцитами тканей интерфазы "самка-зародыш", а на 12-14 сутки резорбция 30-50% зародышей (195). Иммунологическая толерантность к собственным антигенам может быть связана с экспрессией этих антигенов на клетках в количестве, недостаточном для активации потенциальных ЦТЛ, либо недостаточной экспрессией на данных клетках антигенов МНС. Другая форма проявления 15 иммунологической толерантности может быть связана с одновременным присутствием на клетках антигенов, индуцирующих ТЫ и Th2. Известно, что Th2 синтезируют ИЛ-10, подавляющий формирование ЦТЛ (17). Функция иммунобиологического надзора Т-лимфоцитов в "элиминации" чужого проявляется в деструкции соматических мутантов или малигнизированных клеток, в противоинфекционном и противопаразитарном иммунитете. В этом виде иммунитета Т-клетки осуществляют либо прямое цитолитическое действие на клетки, пораженные внутриклеточными патогенами, либо опосредованно через активацию Т-хелперов второго типа и индукцию ими синтеза В-лимфоцитами антигенспецифических антител. 1.1.2. а/р С02+Т-лимфоциты в иммунобиологическом надзоре организма Функционально а/р Т-клетки подразделяются на две большие субпопуляции - хелперную и киллерную. Основными маркерами для них являются: CD4 для Т-хелперов (хотя от 5 до 10% этих лимфоцитов обладают цитотоксической активностью), CD8 для киллеров (43,153,177). а/3 ТКР представляют собой гетеродимер, состоящий из двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидной связью. В мембране клеток ТКР тесно связан с полипептидным комплексом - CD3 антигеном, образуя ТКР комплекс (33,109). CD3 принимает непосредственное участие в трансмембранной передаче активационного сигнала после связывания ТКР с антигеном (34,113). В формировании этого сигнала у Th принимает участие СД4 молекула, а у Т-киллеров - CD8. (43,103,109). а/р Т-клетки, как хелперы, так и киллеры, распознают не сам антиген, а в комплексе его с антигенами МНС. Такой вид распознавания антигена имеет важное биологическое значение, так как он предупреждает блокаду внеклеточными "чужеродными" антигенами ТКР ЦТЛ и, соответственно, подавляет генерацию инфекции внутриклеточными патогенами (33,109,153). 16 Большинство клеток, осуществляющих иммунологический надзор, способны осуществлять антигенпрезентирующую функцию, но ведущая профессиональная роль в этом процессе принадлежит дендритным клеткам (5, 27, 88). Дендритные клетки происходят из предшественников лимфоидного и миелоидного рядов кроветворных клеток (5, 140). Незрелые формы этих клеток преимущественно локализованы в эпителии слизистых оболочек и в эпидермисе, они имеют высокую фагоцитарную активность и низкую антигенпрезентирующую функцию (27). АПК являются первыми клетками системы иммунобиологического надзора, формирующими реакции отторжения "чужого". Дендритные клетки, захватив антиген, перемещаются из интерстиция тканей в микроциркуляторное русло лимфатической системы и далее в Т-клеточные зоны селезенки и лимфатических узлов (5, 88). В процессе этого перемещения происходит созревание дендритных клеток и процессинг ими антигенов. Созревание стимулируют ИЛ-1\|3, ФНОсс, ГМ-КСФ и ПГЕ2 (27), синтез которых индуцируется молекулами клеточной стенки патогенов и их метаболитами (49). Фагоцитированные дендритными клетками антигены подвергаются расщеплению в протеосомах, а затем с помощью ТАР белков (transporter for antigen presentation) транспортируются в просвет гранулярной эндоплазматической сети, где они связываются с молекулами антигенов МНС I класса. (103) Образовавшийся комплекс через аппарат Гольджи транспортируется на плазматическую мембрану, где он и экспрессируется (5,27,103). Образование комплекса "чужеродный" антиген с молекулой МНС II класса происходит иначе. В цитозоле эта молекула находится в комплексе с инвариантной цепью пептида (Л), который закрывает антигенсвязывающую выемку данной молекулы. Из цитозоля комплекс МНС II класса с Л пептидом через эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи попадает в лизосому, где в кислой среде происходит отщепление этого пептида, а его место занимает антигенный пептид. Затем комплекс антиген МНС II класса поступает на цитоплазматическую мембрану (9, 26). 17 Захватывая и процессируя антиген, дендритные клетки проходят стадию созревания, которая сопровождается их миграцией в Т-зоны лимфоидных органов, сближение дендритных клеток с Т-хелперами обеспечивается хемокинами — MIP-3P, SLC, а начальное межклеточное контактное взаимодействие - адгезивными молекулами CD54 (ICAM-1) и CD58 (FLA-3), которые служат лигандами для CD2 и LFA-1 антигенов Т-лимфоцитов. Взаимодействие комплекса антигена и аутологичного антигена I или II класса МНС с комплексом а/р TKP/CD3/CD4 обеспечивает первый активационный сигнал для Т-хелперов (9,112,153). Этот сигнал индуцирует экспрессию данными клетками CD40L, который взаимодействует с CD40 дендритных клеток, что обеспечивает дополнительную активацию дендритных клеток, сопровождающуюся повышением экспрессии на них костимуляторных молекул CD80 (В7-1), CD86 (В7-2) и синтезом ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, ФНОа и ИЛ-15 (83,130,181). ИЛ-1 обеспечивает пролиферацию и предупреждает апоптоз "naive" Т-хелперов (40,113). Помимо этой иммунорегуляторной функции, он осуществляет нейроиммунноэндриное взаимодействие в организме (40). У крупного рогатого скота, как и у других видов млекопитающих, семейство ИЛ-1 содержит три лиганда: ИЛ-1а. ИЛ-ip, ИЛ-IR- антагонист и два рецептора (90). Костимулирующие молекулы CD80 и CD86 дендритных клеток, взаимодействуя с антигеном CD28 на поверхности Т-хелперов, дают им второй сигнал, который опосредуется через активацию специфической фосфодиэстеразы, вызывающей снижение внутриклеточного 3,5 циклического аденозинмонофосфата и стимулирующей экспрессию ИЛ-2Я а также секрецию этого лимфокина. ИЛ-2, как и ИЛ-1, обеспечивает пролиферацию CD4 клеток и их апоптогенную защиту (17,20,169). В то же время у мышей, дефицитных по эндогенному, генетически детерминированному синтезу ИЛ-2, не установлено значительных нарушений в формировании клонов Т-хелперов (168). Недавно было обнаружено, что функцию ИЛ-2 в этом процессе

Список литературы

Цена, в рублях: (при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)	1425

Скачать бесплатно	24756.doc

Найти готовую работу

ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:

Связаться

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ

15.04.24 Задачи, условия и этапы организации экспериментальной работы

15.04.24 Критерии качества преподавания

15.04.24 Категория нормы в обучающей деятельности

Архив материала для курсовых и дипломных работ

Ссылки:

Счетчики:

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.