У нас уже
176407
рефератов, курсовых и дипломных работ
Сделать закладку на сайт
Главная
Сделать заказ
Готовые работы
Почему именно мы?
Ценовая политика
Как оплатить?
Подбор персонала
О нас
Творчество авторов
Быстрый переход к готовым работам
Контрольные
Рефераты
Отчеты
Курсовые
Дипломы
Диссертации
Мнение посетителей:
Понравилось
Не понравилось
Книга жалоб
и предложений
Название
Эффективность генетической трансформации соматический и эмбриональный клеток животнык с использованием различный типов клеток-упаковщиц
Количество страниц
96
ВУЗ
МГИУ
Год сдачи
2010
Бесплатно Скачать
24763.doc
Содержание
Содержание
ВВЕДЕНИЕ... 5
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ... 10
1.1. Ретровирусные векторы как эффективная система переноса чужеродных генов в клетки эукариот... 10
1.1.1. Биологические особенности ретровирусов... 10
1.1.2. Создание ретровирусных векторов... 13
1.1.3. Пакующие линии клеток... 15
1.1.4. Свойства ретровирусных векторных систем и их использование для переноса чужеродной ДНК... 19
1.2. Трансгенные животные биореакторы... 20
1.2.1. Преимущества использование трансгенных животных для
производства рекомбинантных белков... 20
1.2.2 Продукция рекомбинантных белков в молоко трансгенных
животных... 24
1.2.3. Использование ретровирусных векторов для получения
трансгенных животных биореакторов... 25
1.3. Получение трансгенной сельскохозяйственной птицы... 26
1.3.1. Использование вирусных векторов для переноса экзогенной ДНК в эмбриональные клетки птицы... 29
1.3.2. Микроинъекция ДНК в цитоплазму зиготы... 33
1.3.3. Использование эмбриональных стволовых клеток... 34
1.3.4. Использование примордиальных зародышевых клеток... 35
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ... 39
2.1. Реактивы и оборудование... 39
2.2. Используемые генные конструкции и пакующие линии
клеток... 42
2.3. Культивирование клеток... 44
3
2.4. Получение первичной культуры клеток-мишеней... 45
2.4.1. Получение первичной культуры клеток молочной железы... 45
2.4.2 Получение первичной культуры клеток эмбриона курицы... 45
2.5 Трансформация клеток-мишеней in vitro... 46
2.5.1. Совместное культивирование с клетками-«упаковщицами»... 46
2.5.2. Инфицирование культуральной жидкостью, содержащей рекомбинантный ретровирус... 47
2.6. Введение генных конструкций в клетки-мишени in vivo... 47
2.6.1. Введение генных конструкций в молочную железу сельскохозяйственных животных... 47
2.6.2. Введение генных конструкций в эмбрионы кур... 48
2.7. Анализ на наличие генной конструкции (ГШР)... 48
2.8 Анализ экспрессии рекомбинантных белков... 49
2.8.1. Иммуноферментный анализ (ИФА)... 49
2.8.2. Иммуногистохимия... 50
2.9. Получение и приготовление препаратов митотических
хромосом кур... 50
3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ... 52
3.1 Трансформация клеток молочной железы
сельскохозяйственных животных... 52
3.1.1. Трансфекция клеток молочной железы сельскохозяйственных животных in vitro... 52
3.1.2. Введение экзогенной ДНК в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных in vivo... 53
3.1.3. Иммуногистохимический анализ экспрессии рекомбинантного ЭПО в молочной железе опытных животных... 61
3.1.4. Факторы, влияющие на эффективность трансформации
клеток молочной железы in vivo... 64
3.2. Трансформация клеток эмбрионов кур... 66
4
3.2.1. Трансфекция эмбриональных клеток кур in vitro... 66
3.2.2. Введение генных конструкций в эмбрионы кур in vivo... 68
3.2.2.1 Трансформация клеток эмбрионов кур культуральной жидкостью... 69
3.2.2.2 Трансформация клеток эмбрионов кур суспензией клеток-«упаковщиц»... 75
3.2.3. Влияние различных факторов на эффективность трансформации клеток эмбрионов кур... 79
3.3. Сравнительный анализ эффективности использования
пакующих линий клеток AMI 2 npgl3 для трансформации
клеток-мишеней in vitro и in vivo... 82
4 ОБСУЖДЕНИЕ... 85
5 ВЫВОДЫ... 93
6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ... 95
ЛИТЕРАТУРА... 96
Введение
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы.
Для создания трансгенных животных используют целый ряд методов: микроинъекция ДНК в пронуклеус зигот, вирусная трансфекция, использование спермиев как переносчиков ДНК, пересадка ядер трансформированных эмбриональных стволовых клеток, липосомальный транспорт генов [Зиновьева, Эрнст, 2004]. Исторически более ранним методом является метод микроинъекции ДНК, с использованием которого были получены первые трансгенные сельскохозяйственные животные [Hammer et ah, 1985; Brem et ah, 1985]. Однако данный метод характеризуется низкой эффективностью трансгенеза: интеграция рекомбинантной ДНК в зависимости от вида животного наблюдается только в 0,5-1% случаев [Ерем и др., 1995]. Причем около 40% полученных трансгенных животных в последующем не экспрессируют чужеродный белок [Wilmutl. et al.,1991; Hennighausen L. etah, 1992].
В этой связи актуальным является разработка альтернативных методов переноса генов, позволяющих повысить эффективность трансгенеза. Одним из таких подходов является использование ретровирусных векторных систем. Благодаря эволюционно сложившемуся механизму интеграции вирусной РНК в геном клетки-хозяина, ретровирусные векторы позволяют эффективно осуществлять трансформацию клеток-мишеней, как in vivo, так и in vitro. Они самостоятельно проникают в клетки-мишени и эффективно интегрируются в ДНК, не разрушая при этом клетку. Огромным преимуществом данных векторов является возможность их использования для получения так называемых соматических трансгенных животных методом локального (органного) трансгенеза, что позволяет значительно сократить сроки получения трансгенных индивидуумов [Титова В.А., 2001; Волкова НА., 2002; Гвоздь ИМ., 2002]. Ретровирусные вектора рассматриваются в качестве перспективного метода и в случае получения
6
трансгенных кур [Mizuarai S. et ah, 2001; Harvey A.J. et ah, 2002; Mozdziak P.E. et ah,, 2003], особенности воспроизводства которых делают использование метода микроинъекции для этих целей малоэффективным.
Однако эффективность трансформации клеток-мишеней ретровирусными векторами во многом определяется используемой линией клеток, упаковывающих рекомбинантный ретровирус. В этой связи, возникает необходимость в оценке различных линий клеток-«упаковщиц» для использования в трансгенезе соматических и эмбриональных клеток животных in vitro и in vivo.
Цель и задачи исследования.
Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы явилось исследование эффективности генетической трансформации соматических и эмбриональных клеток животных с использованием различных типов клеток-«упаковщиц».
Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:
1. Провести трансфекцию первичной культуры клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур in vitro с использованием двух типов клеток-«упаковщиц» AMI2 upgl3.
2. Изучить динамику экспрессии рекомбинантных белков с молоком соматических трансгенных коров, коз и свиноматок после введения в молочную железу генных конструкций, интегрированных в пакующую линию pgl3.
3. Усовершенствовать метод получения трансгенных кур методом опосредованного ретровирусами переноса генов.
4.Определить эффективность трансформации клеток эмбрионов кур
in vivo на уровне ДНК. 5. Выявить факторы, определяющие эффективность трансформации
клеток эмбриона кур in vivo.
7
6. Дать сравнительную оценку использования двух типов клеток-«упаковщиц» для трансгенеза клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур.
Научная новизна.
В ходе выполнения диссертационной работы впервые проведена оценка двух типов клеток-«упаковщиц» АМ12 и pgl3 для переноса экзогенной ДНК в первичные клетки молочной железы млекопитающих и эмбрионы кур in vitro. Впервые осуществлена трансформация клеток молочной железы коров, коз и свиноматок in vivo пакующей линией pgl3 и изучена динамика экспрессии рекомбинантных белков с молоком опытных животных в ходе лактации.
Впервые оценена эффективность использования ретровирусных векторов для трансгенеза эмбрионов кур in vivo, и на основе сравнительного анализа различных способов введения генных конструкций в эмбрионы кур отработан метод получения трансгенных кур. Получены трансгенный петух, несущий структурный ген эритропоэтина человека в клетках крови, кишечнике, печени, сердце и курица с интеграцией рекомбинантной ДНК (ген гормона роста человека) в сердце, печени, мышцах, яичнике, кишечнике, желудке. Установлено влияние генной конструкции, пакующей линии клеток и типа вирусного препарата на эффективность трансформации эмбрионов кур.
Практическая значимость работы.
Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, имеют практическую значимость. Оценена эффективность использования двух типов клеток-«упаковшиц» AMI2 и pglS для трансгенеза клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур in vitro и in vivo. Усовершенствован метод получения трансгенных кур посредством
8
использования ретровирусных векторов. Выявлены факторы, определяющие эффективность трансформации эмбрионов кур in vivo.
Основные положения, выносимые на защиту:
• Опосредованный ретровирусами перенос генов как эффективный метод доставки экзогенной ДНК в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур in vitro и in vivo.
• Периодичность синтеза рекомбинантных белков в молоко соматических трансгенных животных.
• Влияние генной конструкции, пакующей линии клеток и типа вирусного препарата на эффективность трансформации эмбрионов кур in vivo.
Апробация работы.
Материалы диссертации были доложены и обсуждены:
на международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», Дубровицы, ВИЖ, 2003;
на III международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, ВНИИСБ, 2004;
на международной научно-практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки», Дубровицы, ВИЖ, 2004;
на III международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, Экспоцентр, 2005;
на конференциях отдела биотехнологии ВИЖ, 2002-2005 гг.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
9
Структура и объём работы.
Диссертация изложена на 107 страницах, содержит 11 таблиц, 26 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений. Список литературы включает 110 источников.
10
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Ретровирусные векторы как эффективная система переноса чужеродных генов в клетки эукариот
Семейство Retroviridae (от лат. retro—обратный) — это большая группа РНК-содержащих вирусов, которая характеризуется наличием в составе вирионов РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы), обеспечивающей синтез ДНК на матрице вирионной РНК [Сюрин В.Н., 1998].
1.1.1. Биологические особенности ретровирусов.
Вирионы ретровирусов представляют собой частицы сферической формы диаметром 70-120 нм, состоящие из сердцевины, внутренней белковой мембраны и липосодержащей наружной оболочки, на поверхности которой имеются выступы длиной примерно 8 нм. В сердцевине различают внутреннюю капсулу икосаидрической формы и две копии геномной РНК длиной 5-10 т.п.н. в виде рибонуклеопротеида, расположенного в центре вириона (вирионы типа С) или эксцентрично (вирионы типа В и D) (рис. 1).
двойной слой липидов (происходит из мембраны клетки хозяина)
белок капсида
гликопротеиды в виральной оболочке (env)
реверсивная транскриптаза
Рисунок 1. Схематическое изображение типичного ретровируса.
11
В зависимости от структуры генома выделяют две группы ретровирусов: простые и комплексные [Coffin, 1992]. К группе простых ретровирусов относят вирус саркомы Рауса и вирус лейкемии мышей Молони. Важными представителями комплексных ретровирусов являются вирус иммунодефицита человека - HIV-1, HIV-2 {Barre-Sinoussi et al.,1983; Gallo et ah, 1984; Levy et al.,1984] и вирус лейкемии человека - HTLV-1, HTLV-2 [Poiesz et al, 1980; Kalyanaraman et al, 1982].
Геномная РНК первой группы ретровирусов состоит из трех основных генов: gag, pol и env. Ген gag кодирует белки капсида и вирусного кора, ген pol - вирусную реверсивную транскриптазу и интегразу, ген env -гликопротеиды в вирусной липидной оболочке, которые отвечают за связывание ретровируса с рецепторами, расположенными на поверхности клеточной мембраны клетки-мишени [Weiss et al, 1985]. Геном комплексных ретровирусов помимо вышеназванных генов gag, pol и env включает дополнительно гены, кодирующие неструктурные белки, которые играют важную роль в репликации вирусов.
Геномная РНК ретровирусов фланкирована повторяющимися последовательностями длиной от 10 до 80 нуклеотидов, так называемыми R-сегментами. На 3' конце R-сегмента расположен регион U3 длиной 170-1250 нуклеотидов, а на 5'конце - регион U5 длиной 80-100 нуклеотидов. При транскрипции линейной ДНК-копии вирусного РНК-генома на концах молекулы происходят изменения: на 5' конце располагается сегмент U3, а на 3' конце - сегмент U5. Образующаяся структура принимает вид U3-R-U5. Такие характерные для ДНК-формы ретровируса участки получили название LTR - длинных концевых повторов. LTR, расположенный на 5' конце, несет очень сильный промотор, в то время как LTR, расположенный на 3' конце, содержит сигналы полиаденилирования. LTR необходимы для интеграции провируса в ДНК клетки-мишени и транскрипции вирусной РНК с провирусной матрицы. Строение двухцепочечной ДНК-формы генома
12
ретровируса на примере вируса лейкемии мышей Молони схематично представлено на рисунке 2.
U3 U5
U3 U5
LTR
gag
Энхансер
pol
env
Кэп-сайт
ЦЦААТ ТААТА
Рисунок 2. Строение двухцепочечной ДНК-формы генома ретровируса [по Ibelgaufts, 1990\.
Взаимодействие ретровируса с клеткой-мишенью начинается со связывания белка env со специфическим белком-рецептором. После адсорбции вируса на клеточной мембране происходит "раздевание" РНК и ее проникновение вместе с внутренними белками вируса в клетку.
В цитоплазме на вирусной РНК с помощью обратной транскриптазы синтезируется двухцепочечная ДНК-копия. В ходе транскрипции на 5' и 3' концах ретровируса происходит дупликация последовательностей, приводящая к формированию прямых длинных концевых повторов LTR. Такие молекулы ДНК до момента интеграции находятся в ядре клетки в автономном состоянии в линейной или кольцевой форме. В процессе интеграции происходит отщепление 2 пар оснований на обоих концах ДНК-копий и удвоение 4-6 пар оснований последовательностей ДНК клетки хозяина. Интегрированная в ДНК клетки-мишени форма существования вирусного генома получила название провируса. Интеграция в геном клетки-мишени не является специфической, однако, места интеграции часто располагаются в транскрипционно активных участках ДНК. Если интеграция происходит в геном генеративных клеток, то ретровирусы передаются по
13
наследству потомству. Превратившись после интеграции в часть хромосомы клетки, провирус становится доступным для транскрипции и трансляции. Образующиеся в ходе транскрипции продукты являются идентичными вирусной РНК. Они содержат на 5' конце кэп-сайт, а на 3' конце - участок полиаденилирования. Такие РНК служат материалом для синтеза белков капсида вирусного кора (gag), а также белков реверсивной транскриптазы (pol), которые образуют с геномной РНК ретровируса комплексы (коры), после чего новые вирусные частицы покидают клетку посредством транспорта через цитоплазматическую мембрану. При этом кор захватывает с собой часть мембраны клетки хозяина, образуя оболочку ретровируса. Необходимо отметить, что интеграция вирусных частиц в геном клетки хозяина происходит только в митотически активные клетки. Предшествующее интеграции проникновение прединтеграционного комплекса в ядро происходит во время метафазы II митоза. Интеграция в геном ДНК провируса и образование новых вирусных белков имеет место лишь по завершении процесса митоза [Miller, 1990; Roe et ah, 1993].
1.1.2. Создание ретровирусных векторов
Среди ретровирусных векторов, используемых в настоящее время для переноса экзогенной ДНК в клетки-мишени, наибольшее распространение получили рекомбинантные векторы на основе вируса лейкемии мышей Молони. В последние годы разрабатываются векторы нового поколения, сконструированные на базе вирусов рода Lentiviridae, так называемые лентивирусные векторы. В отличие от векторов на основе ретровирусов данные векторы способны инфицировать неделящиеся клетки [Naldini et ah, 1996].
Принцип конструирования рекомбинантных ретровирусных векторов заключается в следующем: из генома ретровируса вырезают структурные гены gag, pol, env (транс-элементы) и осуществляют их замену на другие
14
гены, исходя из задач исследования [Nilson B.H.K.., 1996; Russell S.J., 1997]. При этом в состав вектора включают цис-элементы, к которым относят:
- энхансер, промотор и сигнал полиаденилирования геномной РНК вируса;
у-область, которая отвечает за формирование вирусных частиц;
- элементы, необходимые для синтеза ДНК провируса на вирусной РЕПС путем обратной транскрипции (участок связывания тРНК или РВ, полипуриновыи участок или РРТ, повтор R на обоих концах вирусной РНК);
- частично инвертированные повторы (att-сайты) на внешних концах обоих длинных концевых повторов (LTR).
Рекомбинантный ретровирусный вектор должен также содержать:
- ген, позволяющий производить отбор клеток с интегрированным вектором на селективной среде, например, ген устойчивости к неомицину neo [Uckert W. etal, 1996];
- фрагмент ДНК, содержащий уникальные участки узнавания для различных рестриктаз, по которым осуществляется введение (клонирование) необходимых генов.
Существуют 4 основных стратегии конструирования ретровирусных векторов.
1. Для запуска транскрипции используют только один 5'-LTR, при этом трансляция разных генов происходит за счет сплайсинга РНК. Вектор может содержать один или два чужеродных гена. В последнем случае второй ген транслируется после сплайсинга. Наличие в клетке как сплайсинговой, так и исходной, несплайсинговой РНК, обуславливает трансляцию обоих генов.
2. Вводимый ген (кодирующий рекомбинантный продукт) ставят под свой собственный промотор. Сконструированный данным образом вектор имеет автономию, где один ген подчиняется вирусному промотору, а другой - своему собственному, пристроенному к нему искусственно.
15
3. Используют полицистронную систему без сплайсинга. В данных векторах гены следуют один за другим. Чтобы обеспечить их трансляцию, между ними вставляют сигнал реинициации из 5'-нетраслируемой области, который дает возможность рибосоме прикрепиться внутри матрицы и инициировать синтез белка. Возможны и другие варианты полицистронных структур. Для селекции трансформированных клеток в ретровирусный вектор вводят маркерный ген, например, ген пео, обеспечивающий устойчивость клеток к антибиотику неомицину [Blake J. et ah, 1997; Emery D.W., 1998; SeamonJ.A., 2002].
4. В последнее время созданы так называемые самоинактивирующиеся векторы. В данных векторах в 3' LTR провируса вносят делецию, которая затрагивает энхансерно-промоторную область U3 района LTR. В результате транскрипции в упаковывающих клетках образуется геномная РНК вектора, способная к нормальной упаковке в ретровирусный вирион. После заражения клетки-мишени образующийся провирус оказывается лишенным промоторно-энхансерной области LTR, что предотвращает образование репликационно-компетентных ретровирусов. Экспрессия гена в таком случае осуществляется внутренними промоторами. Отрицательным свойством такого самоинактивирующегося вектора является его низкий титр.
Репликация ретровирусного вектора возможна лишь в специальных пакующих клетках, в геном которых встроены гены, кодирующие вирусные белки [ГорбуноваВ.Н., 1997; Прасолов B.C., 1989]. Типичная двухкомпонентная ретровирусная векторная система, состоящая из ретровирусного вектора и линии клеток-«упаковщиц», схематично представлена на рисунке 3.
1.1.3. Пакующие линии клеток
Пакующие линии клеток, называемые так же клетки-«упаковщицы», характеризуются тем, что они продуцируют все вирусные белки gag, pol, env.
LTR
LTR
16
Векторная конструкция
gal
I
neo
LTR
Линия клеток-упаковщиков
V
LTR gal mo LTR
РНК
БЕЛКИ
LTR
Рисунок З. Двухкомпонентная ретровирусная векторная система [по Salmons В. et al., 1991].
Эти клеточные линии упаковывают рекомбинантный ретровирус в вирусные частицы и выбрасывают их в окружающую среду [Miller, 1990]. Гены gag, pol, env, используемые для создания пакующих линий клеток, вносят в клеточную линию с помощью плазмиды-помощника. Вырабатываемые клетками-упаковщицами вирусные частицы могут инфицировать клетки-мишени только в том случае, если последние содержат на своей поверхности соответствующие клеточные рецепторы.
Первые пакующие линии клеток представляли собой модифицированную клеточную линию SE21Q1B. Данная линия несла мутированный геном вируса саркомы Рауса, который не мог упаковываться в вирусные частицы [Linial et al, 1978]. Мутация представляла собой делецию в области 5 вирусной РНК. Кроме этого были получены также другие мутации, которые обуславливали неспецифическую упаковку клеточной РНК [Shank and Linial, 1980., Linial, 1981]. Последнее повлекло за собой создание
17
синтетических ретровирусных пакующих линий для упаковки генома специфических рекомбинантных РНК [Mann et ah, 1983].
Разработки по созданию эффективных и прежде всего безопасных пакующих линий шли в нескольких направлениях. При этом важным требованием при создании таких пакующих линий клеток было предотвращение образования репликационно-компетентных ретровирусов, т.к. при конструировании ретровирусных векторов всегда существует опасность их возникновения [Temin,1990; Donahue et ah, 1992]. Репликационно-компетентные ретровирусы так же как и вирус дикого типа способны реплицироваться в клетке-хозяине и тем самым продуцировать инфекционные вирусы, распространение которых может привести к инсерционному мутагенезу и переносу онкогенов в другие клетки [Gray,1991; Grosovsky et ah, 1993]. Репликационно-компетентные ретровирусы возникают в результате рекомбинации плазмиды-помощника с эндогенными ретровирусами, которые присутствуют во всех клетках млекопитающих [Aaronson and Stephenson, 1976; Larsson et al, 1989; Lower et ah, 1993] или рекомбинантным ретровирусом [Chong and Vile, 1996; Chong et al, 1998]. За последние 15 лет разработано множество пакующих линий, причем в зависимости от их безопасности различают три поколения.
При создании клеток-упаковщиц первого поколения использовали пакующую линию с делецией в области сигнала упаковки в вирусные частицы [Mann, et ah, 1983, Cone and Mulligan, 1984; Miller et ah, 1985]. Несмотря на то, что титр вирусных частиц в этих пакующих линиях достигал 107 КОЕ/ мл [Mann et ah, 1983], упаковка рекомбинантных ретровирусных векторов в вирусные частицы происходила с сравнительно низкой эффективностью. К тому же среда культивирования пакующих линий, содержащая рекомбинантный ретровирус, активировала геном линий клеток, которые не несли рекомбинантый ретровирус [Core and Mulligan, 1984; Miller and Buttimore, 1986]. В связи с этим уже после короткого времени культивирования в этих пакующих линиях вновь образовывался сигнал
Список литературы
Цена, в рублях:
(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)
1425
Скачать бесплатно
24763.doc
Найти готовую работу
ЗАКАЗАТЬ
Обратная
связь:
Связаться
Вход для партнеров
Регистрация
Восстановить доступ
Материал для курсовых и дипломных работ
25.03.24
Семантическая классификация фразеологизмов с теологическими и ’ f/ демонологическими компонентами и их дериватами
25.03.24
Принципы определения ареала фразеологизмов с теологическими, демонологическими компонентами и их дериватами
25.03.24
Идея Божественного и демонического в аспекте философских традиций
Архив материала для курсовых и дипломных работ
Ссылки:
Счетчики:
© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.