Бесплатно скачать, заказать диплом, курсовую, диссертацию Молекулярная детекция представителей зипертермофильнык аркей и характеристика аркейной термостаБильной ДНК-полимеразы

У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ

Сделать закладку на сайт

Заказать диплом, курсовую, диссертацию

Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Книга жалоб
и предложений

Название	Молекулярная детекция представителей зипертермофильнык аркей и характеристика аркейной термостаБильной ДНК-полимеразы

Количество страниц	97

ВУЗ	МГИУ

Год сдачи	2010

Бесплатно Скачать	24765.doc

Содержание	Содержание ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7 1. Гипертермофильные микроорганизмы 7 1.1. Места обитания гипертермофилов 8 1.2. Физиологические свойства гипертермофилов 10 1.3. Филогения и таксономия гипертермофилов 12 2. Род Thermococcus 14 2.1. Таксономия и места обитания 14 2.2. Генотипическое разнообразие 20 2.3. Фенотипические свойства 21 3. Возможности промышленного использования ферментов гипертермофилов 26 3.1 Термостабильные ДНК-полимеразы 28 4. Молекулярные методы в микробной экологии 30 4.1. Роль молекулы 16S рРНК в современной таксономии и филогении 30 4.2. ПЦР-клонирование-секвенирование - основная магистраль молекулярного анализа микробных сообществ 32 4.2.1. ПЦР со специфичными праймерами 33 4.3. Электрофорез в денатурирующем градиентном геле 34 4.4. In situ гибридизация 34 4.5. Недостатки методов микробной молекулярной экологии 35 4.6 Сочетание методов классической и молекулярной микробной экологии 37 РЕЗЮМЕ 38 И. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40 III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 52 1. ПЦР-детекция гипертермофильных архей семейства Thermococcaceae 52 1.1 .Специфичность праймеров ТсРс 173F-TcPc589R 52 1.2. Чувствительность метода 57 1.3. Идентификация чистых культур микроорганизмов 59 1.4. Детекция представителей Thermococcaceae в природных образцах и накопительных культурах 61 2. ПЦР-детекция архей в гипертермофильной накопительной культуре, полученной из метантенка, работающего в термофильном режиме 65 2.1. Получение культуры гипертермофильных микроорганизмов 66 2.2. ПЦР-анализ накопительных культур 66 2.3. Амплификация и сиквснс архейных генов 16S рРНК 69 2.4. Физиологические характеристики роста КР4 70 3. Выделение и характеристика архейной термостабильной ДНК-полимеразы 72 3.1. Скрининг коллекции гипертермофильных архей на наличие термостабильных ДНК-полимераз 72 3.2. In situ характеристика отобранных архейных термостабильных полимераз 74 3.3. Выделение и очистка ДНК-полимеразы из штамма Thermococcus sp Shi AM 76 3.4. Молекулярная масса и термостабильность очищенной ДНК-полимеразы 76 3.5. Способность к ПЦР-амплификации ДНК 76 3.6. Характеристика 3'-5'экзонуклеазной активности 80 3.7. Определение частоты ошибок выделенной ДНК-полимеразы 80 4. Клонирование гена ДНК-полимеразы из штамма Thermococcus sp. Shi AM 84 5. Экспрессия гена ДНК-полимеразы из Thermococcus sp. Shi AM 88 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 94 ВЫВОДЫ 96 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 97 Введение ВВЕДЕНИЕ Гипертермофильными называют микроорганизмы с оптимумом роста при температурах выше 80°С (Stetter, 1996a). В отличие от обычных термофилов, они, как правило, не растут при температурах ниже 60°С. За последние 30 лет интерес к гипертермофильным микроорганизмам в научном сообществе постоянно растет. Современные гидротермальные системы можно рассматривать как аналог древних биоценозов Земли. Таким образом, изучение термофильных прокариот является важным как для понимания эволюции микроорганизмов и их метаболических путей, так и для понимания эволюции биосферы в целом. В термальных экосистемах гипертермофильные микроорганизмы могут выполнять функции первичных продуцентов и/или деструкторов органического вещества (Huber et al., 2000). Гипотеза о существовании горячей подземной биосферы, с суммарным количеством биомассы, превосходящим наземную (Gold, 1992), предполагает активное участие термофильных микроорганизмов в современных биогеохимических процессах. Кроме того, исключительная устойчивость их биополимеров к высоким температурам делает их перспективными объектами, как для фундаментальных исследований, так и в связи с возможностью применения в различных областях биотехнологии (Vielle and Zeikus, 2001). Подавляющее большинство гипертермофильных организмов составляют археи (Stetter, 1996a). Предметом рассмотрения данной работы являются гипертермофильные археи, в основном относящиеся к семейству Thermococcaceae и роду Thermococcus. Род Thermococcus входит в порядок Thermococcales царства Euryarchaeota. Род представляет собой филогенетически обособленную и самую многочисленную группу гипертермофильных архей, причем количество описанных видов составляет, очевидно, лишь небольшую часть обитающих в природе. В связи с этим дальнейшие поиски новых штаммов могут проходить как экстенсивно - путем исследования новых экосистем по всему миру, так и интенсивно - за счет выделения новых видов из уже известных местообитаний. Генетическое разнообразие термококков значительно шире, чем это можно было бы предположить на основе их высоко консервативного гена 16S рРНК. Это разнообразие дает основания ожидать у представителей этого рода наличия новых, пока неизвестных физиологических и метаболических свойств. Кроме того, с биотехнологической точки зрения это одна из самых перспективных групп микроорганизмов. Биотехнологический потенциал гипертермофильных архей в большой степени связан с наличием у них термостабильных ферментов, среди которых наиболее широко используемыми и коммерчески успешными являются термостабильные ДНК-полимеразы. Основным преимуществом ДНК-полимераз архей перед термостабильными бактериальными полимеразами можно считать более высокую термостабильность и точность копирования. Все коммерчески используемые архейные ДНК-полимеразы получены из представителей семейства Thermococcaceae. В последние два десятилетия в микробной экологии широко используются методы молекулярной биологии. Главное преимущество и причина широкого использования молекулярных методов, основанных на анализе нуклеотидных последовательностей 16S рРНК, заключается в возможности изучения филогенетического состава микробного сообщества без предварительных стадий культивирования. Ключевым этапом практически всех молекулярно-экологических исследований является амплификация участков генов 16S рРНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Постоянное увеличение числа сиквенсов рРНК в базах данных приводит к необходимости создания все новых праймеров, причем к специфичности праймеров, используемых для детекции и идентификации определенного организма в окружающей среде, предъявляют более высокие требования. В связи с вышеизложенным, детекция гипертермофильных архей в различных экосистемах представляет научный и практический интерес. Наиболее перспективным способом решения этой задачи представляется сочетание традиционных методов культивирования с современными молекулярно-экологическими методами. Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась молекулярная детекция гипертермофильных архей с помощью олигонуклсотидных праймеров, специфичных к генам 16S рРНК, а также оценка биотехнологического потенциала коллекции гипертермофильных архей. Для достижения этой цели следовало решить следующие задачи. 1. Разработать метод молекулярной детекции микроорганизмов семейства Thermococcaceae и провести идентификацию новых гипертермофильных изолятов. 2. Провести ПЦР-детекцию архей в гипертермофильных накопительных культурах и образцах из природных и антропогенных местообитаний. 3. Провести скрининг коллекции термофильных архей лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ им. С.Н. Виноградского РАН на наличие термостабильных ДНК-полимераз. 4. В случае обнаружения термостабильной ДНК-полимеразы детально исследовать ее свойства с точки зрения возможного применения в биотехнологии. ( Научная новизна работы. Впервые разработаны и синтезированы высокоспецифичные олигонуклеотидные праймеры для ПЦР-детекции гипертермофильных архей семейства Thermococcaceae. Доказанная высокая специфичность праймеров позволяет делать выводы о наличии представителей семейства Thermococcaceae в накопительных культурах и природных образцах непосредственно по результатам амплификации. Впервые в системе анаэробной биологической очистки культуральными и молекулярно-экологическими методами обнаружены гипертермофильные архей. В антропогенном местообитании с нейтральным значением рН обнаружен культивируемый представитель царства Crenarchaeota. Результаты исследования расширяют представление о составе микробных сообществ, участвующих в процессе анаэробного разложения органических веществ в системах биологической очистки сточных вод и увеличивают список мест обитания филогенетической группы Crenarchaeota, а также физиологической группы гипертермофильных микроорганизмов. По результатам скрининга коллекции термофильных архей определен штамм, обладающий ДНК-полимеразой с наиболее перспективными свойствами. Из штамма Thermococcus sp. Shi AM выделена и очищена термостабильная ДНК-полимераза, не содержащая интеинов. Показано, что выделенная ДНК-полимераза обладает такими важными с биотехнологической точки зрения свойствами как высокая термостабильность и точность копирования. Выделен и клонирован ген архейной ДНК-полимеразы и получен штамм-продуцент рекомбинантного белка. Практическая значимость работы. Предложен простой, быстрый, надежный и чувствительный метод обнаружения гипертермофильных архей семейства Thermococcaceae, основанный на ПЦР-амплификации генов 16S рРНК с помощью высокоспецифичных олигопуклеотидных праймеров. Выделена и очищена новая архейная термостабильная ДНК-полимераза. Ген, кодирующий эту полимеразу, клонирован и экспрессирован в клетках Е. coli. Полученный фермент может найти широкое применение в молекулярной биологии, генетике, молекулярной диагностике. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конгрессах "Extremophiles'2002" H"Extremophiles'2000", а также на международной конференции "Workshop on Enzymology, Molecular biology and Biochemistry of Thermophiles", 2000. Автор выражает искреннюю признательность к.б.н. Черных Н.А., к.б.н. Лебединскому А.В., к.б.н. Мирошниченко М.Л., к.б.н. Кострикиной Н.А., к.б.н. Туровой Т.П. за помощь на определенных этапах работы. Часть работы, связанная с выделением и клонированием ДНК-полимеразы, проводилась совместно с центром "Биоинженерия" РАН, сотрудникам которого автор выражает свою благодарность, особенно к.б.н. Лопатину С.А. и к.б.н. Эльдарову М.А., практически осуществлявшему научное руководство этой частью работы. Особую благодарность автор выражает научному руководителю д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловской за предложенную тему, обсуждение результатов, ценные советы и замечания и общее научное руководство, а также к.б.н. Слободкину А.И. за постоянное внимание и помощь в работе и при подготовке рукописи диссертации. Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Slobodkina G.B., Chernyh N.A., Slobodkin A.I., Subbotina I.V., Bonch-Osmolovskaya Е.А. Lebedinsky A.V. 2004. PCR-based identification of hyperthermophilic Archaea of the family Thermococcaceae. Appl. Environ. Microbiol. 70:5701-5703. 2. Слободкина Г.Б., Слободкин А.И., Турова Т.П., Кострикина Н.А., Бонч-Осмоловская Е.А. 2004. Обнаружение культивируемой гипертермофильной археи рода Sulfophobococcus в метантенке, работающем в термофильном режиме. Микробиология. 73:716-720. 3. Г.Б. Слободкина, Н.А. Черных, С.А. Лопатин, Г.Е. Ильина, А.В. Банникова, В. Анкенбауэр, М.А. Эльдаров, В.П. Варламов, Е.А. Бонч-Осмоловская. 2005. Выделение и характеристика термостабильной ДНК-полимеразы гипертермофильной археи Thermococcus litoralis Shi AM. Прикладная биохимия и микробиология. 1:40-47. 4. Lebedinsky A.V., Slobodkina G.B., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Schleper CM. 2000. Nested PCR as a method for monitoring Crenarchaeota in mixed cultutes. Abstr. Int. Workshop on Enzymology, Molecular biology and Biochemistry of Thermophiles. 6-12 August 2000, Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia. Book of Abstr., p 27. 5. Lcbedinsky A.V., Slobodkina G.B., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Schleper CM. 2000. Obtaining of a mixed culture containing psychrotrophic Crenarchaeota using nested PCR as a method for monitoring. Abstr. 3th Int. Congress on Extremophiles'2000. 3-7 September, Hamburg, Germany. Book of Abstr. P27, p.95 6. Slobodkina G.B., Subbotina I.V., Lebedinsky A.V., Slobodkin A.I., Bonch-Osmolovskaya E.A., Chernyh N.A. 2002. PCR-based detection and identification of hyperthermophilic Archaea of the family Thermococcaceae. Abstr. 4th Int. Congress on Extremophiles'2002. 22-26 September, 2002, Naples, Italy. Book of Abstr. P47, p. 181. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Гипертермофильные микроорганизмы Отличительной чертой гипертермофильных микроорганизмов является способность к росту при высоких температурах (выше 60°С). Некоторые из них настолько хорошо адаптированы к высоким температурам, что не растут при температуре ниже 80°С (Stetter, 1982; Huber et al., 1989). Современные эволюционные теории предполагают, что, возможно, именно гипертермофильные прокариоты были первыми формами жизни, появившимися на Земле (Stetter, 1996b). Исследования гипертермофильных микроорганизмов определяют и расширяют наши представления о верхней температурной границе жизни. В 1969 году оптимальную температуру роста бактерии Thermus aquaticus -75°С, считали экстремально высокой (Brock and Freeze, 1969). Зафиксированные в настоящее время наивысшие температуры роста составляют 113°С {Pyrolobus fumarii (Blochl et al., 1997)) и 12ГС ('Geogemma barosii" (Kashefi and Lovely, 2003)). Поиск белков, специфичных для гипертермофилов, среди имеющихся в настоящее время полных геномных сиквенсов привел к удивительному результату. Оказалось, только один белок -обратная гираза - присутствует у всех гипертермофилов (у некоторых кренархеот их даже два) и отсутствует у мезофильных и термофильных микроорганизмов (Forterre, 2002). Этот фермент предотвращает раскручивание двойной спирали молекулы ДНК при высоких температурах и поддерживает ее в функциональном состоянии. Обнаружение его только у гипертермофильных микроорганизмов подтверждает правильность выделения их в отдельную группу. Сохранение функционально-активной ДНК было абсолютно необходимо для первых микроорганизмов, преодолевших 80°-градусный температурный барьер. В недавней работе (Atomi et al., 2004) было, напротив, экспериментально показано, что удаление гена обратной гиразы из генома Thermococcus kodakaraensis KOD1 не приводило к летальному исходу при 90°С. Однако ДНК штамма, лишенного этого гена не была положительно суперскручешюй, и рост его был замедлен по сравнению с "нормальным" штаммом, что было особенно ярко выражено при более высоких температурах. 1.1. Места обитания гипертермофилов Гипертермофильные микроорганизмы были выделены почти исключительно из биотопов с температурами от 80°С до 115°С. Естественными местами обитания гипертермофилов являются зоны гидротермальной активности вулканического происхождения, такие как наземные сольфатары и горячие источники, геотермально нагреваемые морские осадки и вода, мелководные и глубоководные гидротермы. В зонах активного вулканизма создаются особые гидрогеологические условия и возникают уникальные природные термальные растворы. Это открытые по флюидному компоненту системы, характеризующиеся высокой скоростью протекающих в них процессов преобразования вещества, для которых обязательной является связь с магматизмом. Химический состав гидротермальных растворов связан через флюид с химическим составом магматического очага и через метеорные воды с атмосферой. Изменение физико-химических параметров растворов по мере их фильтрации к поверхности создает геохимические барьеры (Перельман, 1975), служащие местом развития микробных сообществ. Термофильные микроорганизмы используют магматические газы, теряемые Землей, основными компонентами которых являются Нг, Н2О, CH4, CO, CO2 и соединения серы. Морские гидротермальные системы имеют ряд характерных особенностей, отличающих их от наземных. Прежде всего, они отделены от атмосферы океаном, вода которого несет в себе кислород и сульфаты. Морская вода, проходя через трещины океанической коры, претерпевает ряд изменений и превращается в агрессивный восстановительный флюид. Базальты, из которых состоит океаническая кора, подвергаются воздействию агрессивного флюида. Перегретый, но остающийся жидким из-за огромного гидростатического давления флюид, поднимаясь вверх, несет в себе большие массы выщелоченных из базальтовых пород элементов. Граница вода-дно является важным геохимическим барьером, и большая часть рудного вещества гидротерм отлагается именно на этой границе, образуя металл-сульфидные постройки («черные курильщики») или рассеивается гидротермальными факелами на значительном расстоянии. Микроорганизмы этого биоценоза существуют в экстремальных условиях, подвергаясь воздействию высоких температур и давления, повышенных концентраций тяжелых металлов, резких градиентов всех физико-химических параметров и концентраций веществ, необходимых для метаболизма (Слободкин и др., 1999, Мирошниченко, 2004). Сообщества гипертермофилов были также обнаружены в глубоко залегающих нефтесодержащих слоях геотермально нагреваемых пород (Stetter et al., 1993). Высокие температуры пластовых вод не связаны с вулканизмом, а отражают температурную зональность пород, которые они насыщают (Крайнов и др., 1992). Водообменные свойства горных пород уменьшаются с глубиной, и на глубинах 1-3 км подземные воды, в противоположность гидротермам, можно рассматривать как закрытые системы. Основными газами подземной гидросферы являются Ог, N2, СО2, H2S, CHU, СпН2П+2, Нг, NH3, He, Rn и др. (Шварцев, 1996). Источником органического вещества в глубинных водах служит погребенный органический углерод осадочных пород. Хотя гипертермофилы, как правило, не способны к росту при температурах ниже 60°С, они могут длительное время выживать в таких условиях после попадания туда из подводных гидро- или геотермальных систем. Эта способность подтверждается выделением культивируемых гипертермофильных архей из холодной воды моря Бофорта и Тихого Океана (Huber et al., 1990; Stetter et al., 1993). Из-за низкой растворимости кислорода при высоких температурах и наличия восстанавливающих агентов природные места обитания гипертермофилов практически анаэробны. Однако, находящиеся в контакте с воздухом верхние слои воды в наземных горячих источниках, могут содержать значительные количества кислорода. Примерами микробных мест обитания, созданных деятельностью человека и имеющих повышенную температуру, являются саморазогревающиеся органические материалы (компост, зерно, торф, уголь), системы горячего водоснабжения, сооружения биологической очистки, работающие в термофильном режиме. К настоящему времени наиболее высокотемпературными микроорганизмами, развивающимися в антропогенных биотопах, считаются бактерии рода Thermus и Hydrogenobacter с максимальной температурой роста до 80°С, обнаруженные в компосте, и ацидофильная кренархеота Metallosphaera prunae, выделенная из тлеющего шлакового отвала урановой шахты и оптимально растущая при 75°С (Beffa et al., 1996a, 1996b; Fuchs et al., 1995). 1.2. Физиологические свойства гипертермофилов Единственной физиологической чертой, общей для всех членов этой группы микроорганизмов и отличающей их от других микроорганизмов, является способность к росту при очень высоких температурах. Все прочие физиологические и биохимические свойства гипертермофилов крайне разнообразны: диапазон физико-химических условий роста простирается от строгих аэробов до облигатных анаэробов, от алкалофильных до экстремально ацидофильных. К ацидофильным гипертермофилам относят микроорганизмы, для которых характерен оптимальный для роста рН среды около 3,0 и ниже. Почти все они объединены в порядок Sulfolobales и были выделены из наземных и морских сольфатар. Они растут аэробно (Sulfolobus), факультативно аэробно (Acidianus) и строго анаэробно (Slygiolobus). Большинство нейтрофильных и слабо ацидофильных гипертермофилов являются строгими анаэробами. К гипертермофилам относятся микроорганизмы, растущие как при низкой, так и при высокой солености среды. Также разнообразны и типы метаболизма: на сегодняшний день среди гипертермофилов неизвестны лишь фототрофы, метанокисляющие и нитрифицирующие прокариоты. В термальных экосистемах гипертермофилы образуют сложные пищевые цепи и могут выполнять функции первичных продуцентов и/или потребителей органического вещества. Все гипертермофильные первичные продуценты являются хемолитоавтотрофами, использующими неорганические соединения в качестве доноров и акцепторов электронов (Fischer et al., 1983). В аэробных условиях они способны окислять молекулярный водород до воды, а элементную серу, сульфиды и тиосульфаты окисляют до серной кислоты. В отсутствие кислорода элементная сера, сульфаты, тиосульфаты, сульфиты, нитраты, нитриты, Fe(III) и СОг, служат акцепторами электронов при дыхании, а молекулярный водород является донором электронов. Ferroglobus placidus способен использовать вместо водорода ион двухвалентного железа в качестве донора электронов при восстановлении нитрата (Hafenbradl et al., 1996). Автотрофные гипертермофилы получают клеточный углерод за счет восстановления ССЪ в восстановительном цикле трикарбоновых кислот (Aquifex pyrophilm, Thermoproteus neutrophilus) или через восстановительный ацетил-кофермент А путь (Archaeoglobus lithotrophicus, Ferroglobus 10 placidus) (Kandler, 1993; Ishii et al., 1996). Недавно для членов порядка Sulfolobales был описан новый путь фиксации СО2: цикл 3-гидроксипропионата (Menendez et al., 1999). Некоторые хемолитоавтотрофы являются факультативными гетеротрофами и могут использовать для роста органические вещества. Эти два различных способа метаболизма были показаны, например, у представителей родов Sulfolobus, Metallosphaera, Acidianus, Pyrobaculum, Geoglobus. Облигатные органотрофы растут за счет разных типов дыхания или брожения. В настоящее время известен только один гипертермофил, Легоругит pernix, получающий энергию исключительно за счет кислородного дыхания при росте на сложных органических соединениях (Sako et al., 1996). Для анаэробного дыхания в качестве акцепторов электронов у органотрофов могут служить сера, окисленные серосодержащие соединения, нитрат или Fe(III). Многие гипертермофильные органотрофы являются облигатными сероредукторами, однако все члены порядка Thermotogales и многие члены порядка Thermococcales могут расти независимо от серы, получая энергию от сбраживания субстрата. Известны также микроорганизмы, рост которых ингибируется серой: Pyrolobus fumarii, Sulfophobococcus zilligii, Thermosphaera aggregans. Источниками энергии и углерода для гетеротрофных гипертермофильных микроорганизмов в глубоководных местах обитания, служит сложная смесь пептидов, образующаяся при разложении мортмассы первичных продуцентов. Некоторые виды гетеротрофных гипертермофилов способны использовать сахара (крахмал, пектин, хитин и гликоген). Гипертермофильные железоредукторы обладают уникальными физиологическими свойствами, неизвестными для других гипертермофильных прокариот: способностью к анаэробному окислению органических кислот (Archaeoglobus profundus) (Burggraf et al., 1990), ароматических соединений {Ferroglobus placidus) (Tor and Lovley, 2001) и длинноцепочечных жирных кислот {Geoglobus ahangari) (Kashefi et al., 2002a). В гидротермальных и геотермальных биотопах гипертермофилы выполняют важные функции в процессах минералообразования. Члены порядка Sulfolobales способны выщелачивать тяжелые металлы из сульфидных руд, таких как пирит и халькопирит. Процессы биоминерализации гипертермофилов включают образование магнетита из железа некоторыми железоредукторами (Stetter, 1999; Kashefi et. al, 2002a; Tor et al., 2001). Недавно показано, что процесс образования реальгара из арсената, который ранее считался химическим, может осуществлять гипертермофильная архея 'Pyrobaculum arsenaticuni' (Huber et al., 2000). 11 1.3. Филогения и таксономия гипертермофилов На универсальном филогенетическом дереве, построенном путем сравнения генов 16S рРНК, предложенном Вёзе (Woese et al., 1990), показано разделение всего живого на три домена: Bacteria, Archaea и Eucarya (Рис. 1). Домен Archaea составляют два царства: Crenarchaeota (ветвь Sulfolobales-Thermoproteales) и Euryarchaeota (ветвь экстремальных галофилов, метаногенов и Thermococcales). Глубокие точки ветвления на филогенетическом дереве указывают на раннее разделение групп организмов. Отделение Bacteria от Archaea и Eucarya является самой ранней точкой ответвления. Гипертермофилы представлены среди самых глубоких и коротких линий, и на этом основании можно предположить, что они относятся к очень древним организмам, и что последний общий предшественник всех живых организмов мог быть гипертермофилом. За последние 30 лет интерес к гипертермофилам в научном сообществе постоянно растет. Этот рост выражается в увеличении числа описанных гипертермофильных видов от двух в 1972 году (Brock et al., 1972; Zeikus and Wolfe, 1972) до более 70 к концу 1999 (Hicks and Kelly, 1999); постоянно растущим числом публикаций на эту тему; и тем центральным местом, которое занимают гипертермофилы в проектах по секвенированию полных геномов по всему миру (http//www.tigr.org). К настоящему времени описаны более 75 видов, 32 родов и 10 порядков гипертермофилов (Huber et al., 2000). К гипертермофильным бактериям относятся представители порядков Thermotogales и Aquificales и недавно описанный представитель порядка Thermodesulfobacleriales — Geothermobacterium ferrireducens (Kashefi et al., 2002b). Подавляющее большинство гипертермофилов составляют археи, относящиеся к царствам Crenarchaeota: Sulfolobales, Thermoproteales, Desulfurucoccales, Pyrodictiales и Euryarchaeota: Thermococcales, Archaeoglobales, Methanococcales, Methanobacteriaies, Methanopyrales. Предметом рассмотрения данной работы являются, главным образом, представители гипертермофильных архей рода Thermococcus. 12 Eucarya тая «uurnals microsporidia plants flagellates Bacteria Sulfolobus DCKUl [UKICOCCUS herwofilum gram positives Thcmioprcxcus Pyrobac ulum Aquilex Methanobacierium Archacnglobus Halococcus \ lalobacicrium Methanoplanus Mclhanospinllum Methanosarcina 4 vaMseUii Рисунок 1. Положение гипертермофилов на универсальном филогенетическом дереве, предложенном Вёзе (Woese et al., 1990) 13 2. Род Thermococcus 2.1. Таксономия и места обитания Порядок Thermococcales царства Euryarchaeota домена Archaea составляет одно семейство Thermococcaceae, в которое входят три рода: Thermococcus (Zillig et al., 1983), Pyrococcus (Fiala and Stetter, 1986) и недавно описанный род Paleococcus (Takai et al., 2000). В настоящее время род Thermococcus насчитывает 23 валидно опубликованных вида (Табл. 1), род Pyrococcus - 4 вида, род Paleococcus представлен единственным валидно опубликованным видом Paleococcus ferrophilus. Таким образом, семейство Thermococcaceae является самым многочисленным в домене Archaea. Однако, даже такая многочисленность выделенных видов, по-видимому, является лишь "верхушкой айсберга" того разнообразия видов Thermococcales, которое существует в природе. Из одного и того же биотопа одновременно или в разное время были выделены несколько видов термококков. Так например, Т. celer, Т. litoralis, и Т. alcaliphilus были выделены из мелководной морской сольфатары острова Вулкано, Италия (Zillig et al., 1983; Neuner et al., 1990; Keller et al., 1995), T. aggregans и Т. guaymasensis были выделены из морских осадков, отобранных из глубоководной гидротермы в районе Гуаймас Калифорнийского залива, Мексика (Canganella et al., 1998). Недавно появилось сообщение о выделении 86 изолятов порядка Thermococcales из шести "черных курильщиков", расположенных на одном и том же гидротермальном поле Восточно-Тихоокеанского поднятия. Эти изоляты на основании анализа электрофореграмм продуктов ПЦР, полученных с использованием праймеров, имеющих сайты отжига, распределенные случайным образом по всей длине ДНК (RAPD анализ) были разделены на девять групп, кроме того были получены девять уникальных RAPD профилей (Lepage et al., 2004). Дальнейшие поиски новых штаммов могут проходить как экстенсивно - путем исследования новых экосистем по всему миру, так и интенсивно - за счет выделения новых видов из уже известных местообитаний. Для мест обитания Thermococcus характерны высокая температура, соленость уровня морской, низкий восстановительный потенциал. Два представителя рода Thermococcus были обнаружены в наземных гидротермах Новой Зеландии; оптимум солености среды для них составляет 3,0-5,5 г/л (Gonzalez et al., 1999; Ronimus et al., 1997). На сегодняшний день нет сообщений о выделении термококков из аэробных и/или низкотемпературных экосистем, а также из систем с высоким или низким значением рН.. 14 Таблица 1. Источники выделения и физико-химические параметры роста валидно описанных видов рода Thermococcus Вид Источник выделения Температура роста (°С) рН Концентрация NaCl (г/л) Ссылка Диапазон Оптимум Диапазон Оптимум Диапазон Оптимум Т. acidaminovorans Мелководная морская гидротерма, о. Вулкано, Италия 56-93 85 5,0-9,5 9,0 10-60 20-30 [68] Т. atlanticus Фрагмент стенки активной гидротермальной постройки глубоководной гидротермы Средне-Атлантического Хребта 70-95 85 5,0-8,0 7,0 10-40 23-30 [50] Т. aegaeicus Гидротермально нагреваемый осадок, расположенный на глубине 9.4м, залив Палеохори, о.Милос, Греция 70-90 85 4,5-7,0 6,0 20-80 40 [26] Т. aggregans Морские осадки, отобранные из глубоководной гидротермы (глубина 2000 м) в районе Гуаймас, Калифорнийский залив 60-94 88 5,6-7,9 7,0 10-30 25 [51] Т. alcaliphilus Мелководная морская гидротерма, о. Вулкано, Италия 56-90 85 6,5-10,5 9,0 10-60 20-30 [136] Т. barophilus Морские осадки, отобранные из глубоководной гидротермы (глубина 3550 м) Средне-Атлантического Хребта 48-95 85 4,5-9,5 7,0 10-40 20-30 [154] Т. barossii Фрагмент гидротермальной постройки глубоководной гидротермы, Хребет Хуан де Фука, Восточно-Тихоокеанское Поднятие. 60-92 82.5 3,0-9,0 6,5-7,5 10-40 20 [72] Т. celer Мелководная морская сольфатара, о. Вулкано, Италия до 93 88 5,8 40 [251] Т. chitonophagus Глубоководная морская гидротерма, район Гуаймас, Калифорнийский залив, Мексика 60-93 85 3,5-9,0 6,7 8-80 20 [118] 15 T, fumicolans Глубоководная морская гидротерма, Северные Фиджи. 73-103 85 4.,-9,5 8,5 10-80 20-40 [90] Т. gammatolerans Фрагмент стенки активной гидротермальной постройки глубоководной гидротермы (глубина 2616 м) в районе Гуаймас (27°01'N, 111°24'W), Мексика 55-95 88 4,0-8,0 5,5-6,6 10-35 20 [124] Т. gorgonarius Гидротермально нагретый песок с побережья острова Уэйл, Новая Зеландия 68-95 80-88 5,8-8,5 6,5-7,2 10-50 20-35 [162] Т .guaymasensis Морские осадки, отобранные из глубоководной гидротермы (глубина 2000 м) в районе Гуаймас, Калифорнийский залив, Мексика 56-90 88 5,6-8,1 7,2 10-50 30 [51] Т. hydrothermalis Глубоководная морская гидротерма, Восточно-Тихоокеанское Поднятие, 21°N 53-100 85 3,5-9,5 6,0 20-80 30-40 [91] Т. litoralis Мелководная морская сольфатара, о. Вулкано, Италия 55-98 85 4,0-8,0 6,0 18-65 25 [170] Т. pacificus Гидротермально нагреваемый осадок, расположенный на глубине 40м, Залив Пленти, Новая Зеландия 70-95 80-88 6,0-8,0 6,5 10-60 20-35 [162] Т. peptonophilus Морская глубоководная гидротерма, западная часть Тихого океана 60-100 85-90 4,0-8,0 6,0 10-50 30 [94] Т. profundus Морская глубоководная гидротерма (глубина 1400 м), Средне-Окинавская Впадина, Япония 50-90 80 4,5-8,5 7,5 10-60 20-40 [139]

Список литературы

Цена, в рублях: (при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)	1425

Скачать бесплатно	24765.doc

Найти готовую работу

ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:

Связаться

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ

15.04.24 Задачи, условия и этапы организации экспериментальной работы

15.04.24 Критерии качества преподавания

15.04.24 Категория нормы в обучающей деятельности

Архив материала для курсовых и дипломных работ

Ссылки:

Счетчики:

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.