Бесплатно скачать, заказать диплом, курсовую, диссертацию Хромосомный анализ история, современное состояние. Методы, развитие и периодизация

У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ

Сделать закладку на сайт

Заказать диплом, курсовую, диссертацию

Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Книга жалоб
и предложений

Название	Хромосомный анализ история, современное состояние. Методы, развитие и периодизация

Количество страниц	145

ВУЗ	МГИУ

Год сдачи	2010

Бесплатно Скачать	25124.doc

Содержание	I. Введение. 4 II. Развитие хромосомного анализа, возможность периодизации. 8 III. Дифференциальное окрашивание хромосом. 21 1. Q-дифференциальное окрашивание (Q - бэндинг). 21 2. С-бэндинг. Гетерохроматин. 36 3. G-бэндинг 48 4. R-и Т-окрашивание. 51 5. Окрашивание серебром - ЯОР (М(Ж)-бэндинг. 52 6. Метод N-дифференциального окрашивания хромосом. 53 7. Cd- и Kt- окрашивание. 54 8. Высокоразрешшощий бэндинг. 56 9. Нуклеазный бэндинг. 57 10. Выявление сестринских хроматидных обменов. 60 11. F-бэндинг 62 12. Ну-бэндинг. 63 13. Флуорохромирование препаратов хромосом красителями, 64 специфичными для AT и ГЦ пар оснований. 14. Итоговые замечания по рассмотрению дифференциального 66 окрашивания хромосом. 15. Молекулярные механизмы дифференциального окрашивания 70 и природа бэндов. IV. Другие методы хромосомного анализа. 81 1. Методы гибридизации in situ. 81 2. Микродиссекция хромосом и их отдельных участков. 87 3. Методы анализа изображений для цитогенетического анализа 92 и физического картирования. V. Некоторые проблемы, решаемые с помощью хромосомного анализа. 102 1. Видообразование и хромосомный анализ. 102 2. Исследование хромосом растений с помощью методов 104 дифференциального окрашивания. 3. Исследования хромосом растений, проводимые в Лаборатории 112 функциональной морфологии хромосом института Молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН. VI. Заключение. 121 VII. Выводы. 143 VIII. Библиография. 145 Введение I. Введение. Хромосомный анализ - мощный инструмент генетики и молекулярной биологии, направленный на изучение генома. Его история насчитывает свыше ста лет - с тех пор, как В. Флемминг в 1879 году впервые наблюдал продольное расщепление хромосом при делении клетки аксолотля. В последующие годы хромосомы были обнаружены и описаны у множества самых разнообразных объектов как животного, так и растительного происхождения. Достигнутые успехи определялись в первую очередь совершенствованием оборудования и методик приготовления хромосомных препаратов. Первостепенное значение имело развитие техники микроскопирования и усовершенствование самих микроскопов. Естественно, что в течение всего этого времени неоднократно предпринимались попытки рассмотрения истории хромосомного анализа и определения его места в биологии и медицине (С.Г.Навашин, 1916, 1921; Левицкий, 1931; White, 1978; Дарлингтон, Ла Кур, 1980; Восток, Самнер, 1981; Прокофьева-Бельговская, 1986; Hsu 1992, 1995). Хромосомный анализ является органической частью геномного анализа. Впервые термин «геном» был предложен в 1920 году Г. Винклером (Winkler, 1920) для обозначения гаплоидного набора хромосом данного вида. Естественно, что на этом этапе понятия хромосомного и геномного анализа практически совпадали. По мере развития генетики и молекулярной биологии понятие геномного анализа претерпевало значительные изменения. Геномный анализ включает в себя много разделов в зависимости от методов исследования. Так в цитогенетике растений традиционно под геномным анализом подразумевалось исследование филогенетического родства видов и определение геномного состава полиплоидов в пределах родственных систематических групп на основе анализа конъюгации хромосом в мейозе гибридов (Rosenberg, 1909). На современном этапе термин «геномный анализ» используется в более широком смысле, он также подразумевает, в первую очередь, выявление первичной структуры генома, т.е. определение последовательностей всех составляющих его нуклеотидов; включает в себя установление происхождения видов и оценку генетического родства геномов, на основании анализа различных классов уникальных и повторяющихся последовательностей ДНК, структуры хромосом и сравнительного генетического картирования, структуры генов и спейсерных последовательностей (Friebe, Gill, 1996). Последние достижения в геномном анализе неразрывно связаны с использованием и развитием методов молекулярной биологии: различные варианты амплификации ДНК (RFLP, PCR и др.) и цитологических подходов (дифференциальное окрашивание хромосом и гибридизация in situ, сравнение структуры геномов с легко изменяющимися (полиморфными) участками). Понятно, что ни один из вышеперечисленных методов не является всеобъемлющим и безошибочным. Эффективность методов определяется степенью, в которой они решают поставленные задачи, в частности характеризуют прямо или опосредованно сходство ДНК между видами. Несмотря на все эти достижения хромосомный анализ остается крайне важной, а в отношении некоторых объектов основной частью геномного анализа. Традиционно хромосомный анализ начинается с установления числа хромосом и определение их размеров и морфологии (центромерный индекс, наличие и положение вторичных перетяжек). Впоследствии эти подходы были дополнены хромосомным бэндингом и гибридизацией in situ для анализа не только митотических, но и мейотических хромосом. Помимо этого методы геномного анализа включают в себя анализ мейотической коныогации хромосом в гибридах, микроспектрофотометрию окрашенных по Фельгену препаратов, проточную цитометрию, сравнительное картирование ядерного, пластидного и митохондриального геномов, микродиссекцию и микроклонирование, системы компьютерного анализа изображения. Представляет интерес соотношение понятий хромосомный анализ и кариология. В строгом смысле кариология - это наука о ядре, т.е. понятие более широкое, чем хромосомный анализ. Однако некоторыми авторами (White, 1978; Воронцов, 1980) эти понятия практически отождествляются. Хромосомный анализ - составная часть кариологического анализа - проводится с помощью арсенала различных методов. По мере появления новых методов расширяются возможности и эффективность хромосомного анализа. Хромосомный анализ начал формироваться давно. На каждом этапе создания новых технологий, используемых в нем, хромосомный анализ определялся по-разному. Поначалу он представлял собой описание морфологии хромосом для целей ботаники, зоологии и медицины. В дальнейшем он расширился за счет появления новых методов анализа и увеличения числа исследуемых объектов. В настоящее время хромосомный анализ - это не просто описание кариотипа, а изучение хромосом с помощью комплекса методов, позволяющих получать разностороннюю информацию об изучаемом объекте. Наиболее интенсивно развиваются исследования в тех областях, где они могут быстро приносить практическую пользу (медицинская цитогенетика, включая пренатальную диагностику наследственных заболеваний, селекция новых сортов растений и пород животных). В то же время, последнее десятилетие ознаменовалось стремительным прорывом в развитии науки, связанным с расшифровкой генома человека и ряда других видов животных, растений и микроорганизмов. Таким образом, созданные ранее классификации хромосомного анализа по ряду объективных причин не могли охватить достижений молекулярной биологии последних лет. С другой стороны, прогресс в определении первичной структуры генома лег в основу создания принципиально новых методов и подходов к изучению хромосом. В связи с перечисленными фактами, назрела насущная необходимость пересмотра истории хромосомного анализа в свете современных представлений и определения его места в биологической науке сегодняшнего дня. Это и послужило целью диссертационной работы. Цель работы заключается в рассмотрении истории хромосомного анализа с учетом достигнутого прогресса в исследованиях геномов, выделении отдельных периодов его развития и определении наиболее перспективных направлений, конкретно в решении следующих задач: - описании ключевых этапов развития хромосомного анализа за весь период его существования; - рассмотрении основных методов исследования хромосом, характеристики наиболее широко используемых их модификаций, описании истории создания и области применения; - определении места и роли хромосомного анализа в геномную эру; - выделении основных этапов развития хромосомного анализа. II. Развитие хромосомного анализа, возможность периодизации. Различными авторами предпринимались попытки рассмотрения истории хромосомного анализа (White, 1978; Дарлингтон, Ла Кур, 1980; Босток , Самнер, 1981; Прокофьева-Бельговская, 1986; Hsu 1992, 1995). Наиболее полную классификацию этапов его развития предложил известный австралийский цитогенетик и эволюционист М. Дж. Уайт в 1978 году (White, 1978). Он выделил шесть этапов развития кариологии: ¦ альфа-кариология - определение числа и размеров хромосом; ¦ бэта-кариология - детализация признаков кариотипа: определение относительной длины плеч хромосом, положения центромеры, выявление половых хромосом и пр.; ¦ гамма-кариология - идентификация специфических районов хромосом с использованием методов дифференциальной окраски; ¦ дельта-кариология - определение локализации сателлитной ДНК, ядрышкообразующих районов (рДНК), локусов, содержащих гены бБ-рибосомной РНК; ¦ эпсилон- и зета-кариологии - выявление активно работающих участков на хромосомах типа «ламповых щеток» и политенных хромосомах, что позволяет получить детальные карты строения и функционирования хромосом. Классификация Уайта получила широкую известность в нашей стране благодаря ее пропаганде в работах Н.Н. Воронцова (Воронцов, 1980; 1986). Необходимо отметить, что эта классификация достаточно условна, поскольку она исторически не выдержана, и ряд направлений хромосомного анализа, выделенных им в качестве самостоятельных, развивался параллельно. Так исторически эпсилон- и зета-кариологии начали активно развиваться раньше дельта-кариологии, возникающей и активно развивающейся на наших глазах. Если быть точными, то Уайт описывает не этапы развития кариологии, а разделы хромосомного анализа. А конкретнее - вышеперечисленные этапы развития кариологии представляют собой детализацию наших знаний о хромосомах и кариотипе в целом. Поэтому классификация Уайта выглядит несколько однобокой. Она основана скорее на методических 8 подходах изучения хромосом, и при этом в нее по историческим причинам не входят новейшие методы. Однако она позволяет судить по крайней мере о некоторых важных этапах развития учения о хромосомах. Новейшая, молекулярная, кариология зарождается лишь сейчас; ее задачи - изучение молекулярной организации и функционирования хромосом. Современный хромосомный анализ - понятие достаточно условное. Так при исследовании хромосом человека анализ позволяет судить о множестве черт и особенностей хромосом: содержании в них ДНК, рисунке их окрашивания, наличии перестроек вплоть до выявления генных кластеров и индивидуальных генов. В то же время для многих организмов, в том числе для водорослей, мхов, грибов, лишайников большой проблемой является само определение числа хромосом. На самом примитивном уровне остается пока и изучение хромосом многих простейших, грибов, некоторых групп беспозвоночных и многих групп высших растений (Bennett, 1998). Между тем, по классификации Уайта, этот этап можно отнести к альфа - кариологии, которая зародилась еще в конце 19 века. С 1831 года, т.е. с момента открытия английским ботаником Робертом Броуном клеточного ядра, началось активное изучение как его химического состава, так и функционального значения отдельных структур и компонентов. Уже в 1868 году Мишер выделил ДНК, а несколько позднее Коссель открыл гистоны. Параллельно шло развитие генетики (работы не были связаны с наблюдением хромосом). Несмотря на то, что в 1865 году была опубликована фундаментальная работа Грегора Менделя, в которой он сформулировал законы наследственности, свое официальное начало генетика ведет с 1900 года после переоткрытия законов Менделя тремя исследователями: Гуго Де Фризом, Карлом Корренсом и Эрихом Чермаком. В конце 70-х гг. XIX века поведение хромосом изучалось многими исследователями, но наиболее значительный вклад в эту область знания внесли Э. Страсбургер и В. Флемминг. В 1880 году Флемминг наблюдал продольное расщепление хромосом при делении клетки, а 9 двумя годами позже он предложил термин «митоз». В принципе этот период развития хромосомного анализа ознаменовался установлением самого факта существования хромосом и их описания. В 1903 - 1904 гг. В. Сэттон и Т. Бовери (Sutton, 1903; Boveri, 1904) показали, что именно хромосомы являются материальными носителями менделевских факторов наследственности. С этого времени начался новый этап изучения хромосом. В последующие годы хромосомы были обнаружены и описаны у множества других объектов. Достигнутые успехи определялись совершенствованием оборудования и методик приготовления хромосомных препаратов. Важнейшее значение имело развитие методов микроскопирования и усовершенствование самих микроскопов. Среди важнейших этапов развития микроскопических методов Дарлингтон и Ла Кур (Дарлингтон, Ла Кур, 1980) выделяют создание: И водоиммерсионных объективов (1850г.) Ш осветителя для микроскопа (1873г., Э. Аббе - ведущий конструктор фирмы Карл Цейсе) И масляной иммерсии и масляноиммерсионного объектива (1878г., Э. Аббе) ¦ апохроматического объектива (1886г.) Таким образом к началу 20 века было завершено создание светооптического микроскопа, позволяющего достигнуть разрешения до 0.2 мкм. Последующие сто лет стали веком совершенствования микроскопической техники, в частности были созданы: ¦ объективы с широким полем зрения; ¦ фазово-контрастная (Mickel, 1941; Burch, Stock, 1942) и электронная микроскопия; ¦ создание и развитие флуоресцентной микроскопии; ¦ использование электронной микроскопии для исследования политенных хромосом. ¦ создание и активное использование компьютерных систем анализа изображения; 10 Параллельно совершенствовались методики приготовления препаратов. В 60 - 80-е гг. Х1Хв. были подобраны и внедрены в практику консервирующие жидкости (фиксаторы) и клеточные красители, создание которых продолжается до сих пор. Следует отметить, что именно разработка новых способов приготовления препаратов имела ключевое значение для развития хромосомного анализа. Долгое время хромосомы как животных, так и растений изучали на тканевых срезах. Такие препараты содержали в основном разрушенные митозы, хромосомы накладывались одна на другую, образуя клубки, плохо поддающиеся анализу. Технологии, основанные на использовании суспензий клеток (человек и животные) или приготовлении давленых препаратов (растения) позволили преодолеть эти трудности. Позже для исследования хромосом стали применять метод раскапывания клеточной суспензии. При этом дополнительно стали использовать У:"'.:.:'"..-'.' . •¦ ':'- .'¦ протеолитические ферменты - трипсин, коллагеназу или гиалуронидазу - с целью дезинтеграции образцов тканей и получения суспензии, состоящей из отдельных клеток (Макгрегор, Варли, 1986). Параллельно с этим изучали нетипичные хромосомы: в 1881 году Бальбиани описал политенные хромосомы слюнных желез личинок двукрылых (Chironomus), а Флемминг, исследуя ооциты аксолотля, обнаружил хромосомы типа ламповых щеток. В течение последующих 50-70 лет в основном совершенствовались лишь методики выделения таких хромосом из ядер. Т.Х. Морган С именем Т.Х. Моргана и его школы связан совершенно новый этап развития генетики - установлена связь учения о хромосомах с генетикой. 11 Представления о линейном расположении генов, об их сцеплении и кроссинговере позволили предсказывать многочисленные явления. Картина внутреннего строения хромосом, предложенная Морганом, стала одним из главных обобщений биологии, превратилась в неопровержимый факт, подтвержденный всем развитием генетики. Именно Морган, опытный экспериментатор, обратил внимание на незаменимые качества такого лабораторного объекта, как дрозофила (короткий жизненный цикл -11-12 дней, легкость и простота разведения). Такой объект требовался Моргану в опытах по получению искусственных мутаций (Morgan, 1907). Появившийся объект принес неожиданный успех не только Моргану и его «дрозофильной группе», но и стал незаменимым для всех генетиков \ впоследствии. Сейчас изучение политенных хромосом и хромосом типа ламповых щеток представляет собой отдельную область хромосомного анализа. Получены детальные карты строения и функционирования политенных хромосом слюнных желез дрозофилы, в том числе основанные на электронно-микроскопических фотографиях политенных хромосом, выделенных из клеток и растянутых с помощью микроманипулятора (Ананьев, Барский, 1985). с р Навашин. В 20-30-е гг. XX в. прогресс хромосомного анализа определялся в основном изучением растительных объектов, сравнительная кариология растений резко опережала сравнительную кариологию животных. Этим она обязана трудам С.Г.Навашина (Навашип, 1910, 1911, 1912, 1914), Т. Сакамуры (Sakamura, 1915, 1920) и ГА. Левицкого (Левицкий, Кузьмина, 1927; Lewitsky, Tron, 1930; Левицкий, 1931а, Левицкий,1931). Наиболее 12 интересные данные и теоретические выводы в этой области принадлежат С. Г. Навашину и его школе. В 1912 году на заседании Императорской академии наук России С. Г. Навашин сделал сообщение, которое стало впоследствии знаменитым, «О диморфизме ядер в соматических клетках у Galtonia candicans» (семейство Liliaceae). На данном растительном объекте С. Г. Навашин впервые обнаружил наличие мельчайших постоянных придатков, присоединенных «ниточками» к двум хромосомам. Именно эти придатки и были названы Навашиным спутниками («satellites»). С.Г. Навашин показал, что эти тельца являются постоянной составной частью двух из четырех хромосом, т.к. при делении ядра они «расщепляются вместе с остальным телом хромосомы». Именно С. Г. Навашин впервые показал возможность различать хромосомы по особенностям их строения^. А в 1916 году в юбилейном сборнике, посвященном К.А. Тимирязеву, вышла в свет работа С.Г. Навашина о внешних признаках внутренней организации хромосом (Навашин, 1916). Объектами исследования были хромосомы лилейных (рода Fritillaria и рода Galtonia). Работа иллюстрирована Рис L <<Расчленение хромосом» у рисунками, уникальными по тонкости Fritillaria tenella. изображенных на них деталей для цитологической литературы того времени (рис. 1). Большое значение в кариосистематике растений сыграли также труды другого классика науки в области цитогенетики Г.А. Левицкого (одного из наиболее выдающихся учеников академика С.Г. Навашина). Продолжая научное направление своего учителя, Г.А. Левицкий обогатил наши знания о строении и изменениях хромосом. Благодаря ему, русская школа в исследованиях морфологии хромосом стала всемирно известной, получив название 13 «классической». Г.Л. Левицкий - автор первого -~^~,~ русского руководства по цитогенетике «Материальные основы наследственности» (Левицкий, 1924), по которому учились в 20-30-х годах ХХв. Он наиболее тщательно для своего времени (1910-1913) изучил строение и размножение митохондрий (хондриосом), разработав специальный фиксатор, позволивший установить детали микроскопической организации митохондрий и показать их преемственность путем деления (Прокофьева-Белыовская, 1980). Основная научная деятельность Г.Л. Левицкого Г.А. Левицкий. была посвящена исследованиям морфологического строения хромосом. В 1931 году вышла в свет его работа «Морфология хромосом», в которой он предложил новую методику фиксации и окраски для выяснения особенностей строения хромосом культурных растений (ржи, ячменя, гороха, пшеницы, сахарной свеклы) и некоторых классических в цитологическом отношении растений (Najas, Muscari). Левицким было установлено, что открытое С.Г. Навашиным строение хромосом Galtonia candicans из двух плеч является общей закономерностью строения хромосом, основным принципом их организации. В круг интересов ученого входили вопросы систематики и эволюции (Левицкий, Кузьмина, 1927; Lcvvitsky, Tron, 1930; Левицкий, 1931а). Г.А. Левицкий - один из основателей радиационной генетики растений (Левицкий, Араратян, 1931). «Перед глазами цитолога, жившего до сих пор в атмосфере строгих и прочно установившихся внутриядерных соотношений, развертывается при исследовании рентгенизованиых корешков непривычная и жуткая картина причудливых, поистине калейдоскопических преобразований «материальных носителей наследственности» — 14 хромосом, утративших свою обычную устойчивость», - так Левицкий описывает свои первые впечатления от увиденной им картины хромосом, подвергнутых действию рентгеновских лучей. Г.Л. Левицкий ввел термин и развил учение о кариотипе (Левицкий, 1931), атермин «идиограмма» предложен его учителем С.Г. Навашиным (Навашин, 1921). Под «идиограммой» Навашин обозначил «совокупность метафазных хромосом в качестве элементов символа вида». В таком понимании термин не получил дальнейшего распространения. Г.Л. Левицкий изменил его содержание и под «идиограммой» обозначил графическое изображение совокупности признаков хромосом (их длины, относительных размеров плеч, вторичного расчленения). В таком понимании термин «идиограмма» получил широкое распространение и стал достоянием цитологии (Прокофьева-Бельговская, 1980). В настоящее время под кариотипом подразумевается совокупность признаков, по которым можно идентифицировать данный хромосомный набор: число хромосом, их форма, определяемая прежде всего положением центромер, наличие вторичных перетяжек, спутников,чередование эухроматиновых и гетерохроматиновых районов и т.д. Кариотип образно называют паспортом вида (Инге-Вечтомов, 1989). Таким образом, хромосомы характеризуются длиной, положением центромеры и наличием или отсутствием вторичных перетяжек и спутников. Предложено несколько систем классификаций хромосом, в основе которых Т А ST SM м Л'' 1 ... S ¦ L со 7,0 3.0 1.7 1.0 Arm ratio (r) Рис.2. Классификация Левана. лежит группировка по морфологическим (морфометрическим) признакам. Широкое (повсеместное) распространение получила классификация, в основу которой взята величина 15 (г = L/S, где L- длина длинного плеча хромосомы, a S - короткого) соотношения плеч хромосомы (Levan et al., 1964; рис. 2). Данная классификация достаточно произвольна,согласно ей хромосомы делятся на телоцентрические (Т), акроцентрические (А), U. я Е О о > и с ф и о субтелоцентрические (ST), субметацентричесткие (SM) и метацентрические (М). Позже были предложены ТАМ (Imai, 1978; рис. 3) и AM (Imai, Crozier, 1980; рис. 3) классификации, основанные на не случайном местоположении центромеры (которое определяется путем соотношения короткого плеча - S -хромосомы к общей длине хромосомы гаплоидного набора) А й Т А м 1 AM system ТАМ system 0.1 .6 Size of short arms IS) C/2 Рис.3. ТАМ и АМЪзассификация. 0.1 .6 С/2 С {—) Size of heterochromatlc short (Sh) or long (Lh) агтз I—) Size of euchromatfc short arms (Se) [Imai, 1975, 1976, 1991]. В 90-х гг. 20 века, взяв за отправную точку Рис.4. Модифицированная классификация ТАМ. предположение о том, что ни одна из вышеупомянутых систем не может подойти для описания сложных образцов С-бэндинга эукариотических хромосом, была предложена модифицированная ТАМ классификация (Imai, 1991; рис. 4). 16 Короткое плечо хромосомы, длинное и общая (вся) длина хромосомы соответственно были обозначены S, L, С (от англ. Short, long, Chromosome) и C=S+L. Величины Sc, Le, Sh и Lh были предложены для обозначения короткого и длинного плеча эукариотической хромосомы, а также для полностью гетерохроматических коротких и длинных плеч хромосомы. В Q 1 Is8 L» Iе Iе b Se С e M (t Mh M результате хромосомы Д U Ц А Дм дМ дМ дМ »f\| yh подразделили натри категории: 1. Хромосомы с Sc и Le. n с г- пи г, к Рис.5. Е, EH, H хромосомы. 2. Sh и Le или Se и Lh хромосомы. 3. Sh и Lh хромосомы. Для упрощения терминологии эухроматические плечи (Se и Le) и гетерохроматические плечи (Sh и Lh) были сокращены до Е и Н соответственно. И перечисленные выше три категории хромосом стали Е хромосомы, ЕН хромосомы и Н хромосомы соответственно (рис. 5). Многие виды растений имеют сходные хромосомы, которые невозможно различить при монохромном окрашивании (ацето-кармином, ацето-арсеином или окрашиванием по Фельгену) [Зурабишвили и др., 1974], что ограничивает применение кариотипического анализа. В этом случае используют анализ мейотических хромосом (мейоз моносомных или транслокационных линий, где хромосомы не образуют бивалентов и легко идентифицируются). Так в свое время были охарактеризованы хромосомы пшеницы, хлопка, табака и т.д. Данный подход до сих пор используется при анализе некоторых видов. Но уже в 30-40-х гг. XX века появились первые сведения о возможности изучения хромосом, основанные на неоднородности их окрашивания. В частности:

Список литературы

Цена, в рублях: (при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)	1425

Скачать бесплатно	25124.doc

Найти готовую работу

ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:

Связаться

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ

15.04.24 Задачи, условия и этапы организации экспериментальной работы

15.04.24 Критерии качества преподавания

15.04.24 Категория нормы в обучающей деятельности

Архив материала для курсовых и дипломных работ

Ссылки:

Счетчики:

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.