Бесплатно скачать, заказать диплом, курсовую, диссертацию Изучение органоспецифичных механизмов оксидативного стресса

У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ

Сделать закладку на сайт

Заказать диплом, курсовую, диссертацию

Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Книга жалоб
и предложений

Название	Изучение органоспецифичных механизмов оксидативного стресса

Количество страниц	147

ВУЗ	МГИУ

Год сдачи	2010

Бесплатно Скачать	25125.doc

Содержание	Содержание Оглавление Условные обозначения 4 Введение б Глава 1. Обзор литературы 13 1.1 Патофизиология оксидативного стресса... 13 1.1.1 Причины возникновения свободно-радикальных молекул и их основные типы... 15 1.1.2 Последствия оксидативного стресса... 21 1.2 Антиоксид антная система и внутриклеточный окислительно-восстановительный потенциал... 23 1.3 Характеристика доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса... 30 1.4 Современные фармакологические подходы к снижению токсичности доксорубицина... 37 Глава 2. Материалы и методы 2.1 Характеристика экспериментального материала... 46 2.2 Методы исследования... 46 Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 52 3.1 Характеристика доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса... 52 3 3.2 Влияние глицина на доксорубицин-индуцированный окси-дативный стресс... 59 3.3 Влияние мелатонина на доксорубицин-индуцированный оксидативный стресс... 72 3.4 Влияние унитиола на доксорубицин-индуцированный оксидативный стресс... 86 3.5 Влияние эритропоетина на доксорубицин-индуцированный оксидативный стресс... 99 3.6 Сравнительная характеристика влияния глицина, мелатонина, унитиола и эритропоетина на механизмы доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса . . 115 Заключение 139 Выводы 145 Литература 147 Введение Условные обозначения Апо-А1 АТФ АФК АФА ГР TSH rssr TST ДОК МДА НАДН2 НАД+ НАДФН2 НАДФ+ НХО1 СРО ЭПО ARE В ах Вс1-2 Cu/Zn-СОД - аполипопротеин А1; - аденозинтрифосфат; - активные формы кислорода; - активные формы азота; - глутатион редуктаза - восстановленный глутатион; - окисленный глутатион; - глутатион-Б-трансфераза; - доксорубицина гидрохлорид; -малоновый диальдегид; - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный; - никотинамидадениндинуклеотид окисленный; - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный; - никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный; - НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктаза1 - свободно-радикальное окисление; - эритропоетин; - цис-действующая энхансерная последовательность ДНК активируемая антиоксидантами; - проапоптотический белок семейства Bel; - семейство белков, участвующих в запуске программы апоптоза; - антиапоптотический белок семейства Bel; - антиапоптотический белок семейства Bel; - медь/цинк - содержащая супероксиддисмутаза; ERK1/2 GATA-4 JAK H0C1 IRP-1 МАРК Мп-СОД NF-^B NO OH' p53 R-OO' Ras RORq; STAT Trx(SS) Trx(SH2 - внутриклеточный механизм передачи сигнала регулируемый киназами (Extracellular signal-regulated kinase); - фактор транскрипции GATA-4 - киназа Януса/ (Janus kinase/); - гипохлорная кислота; - белок регулирующий внутриклеточную концентрацию железа (iron regulatory protein); - митоген-активируемая протеинкиназа; - марганец-содержащая супероксиддисмутаза; - ядерный фактор транскрипции кВ; - оксид азота (II); - супероксид-анион радикал; - гидроксильный радикал; - белковый фактор транскрипции р53 (protein 53); - пероксильный радикал; - мембранная мономерная ГТФаза; - "сиротский"рецоптор типа а; - группа белков трансдукторов сигналов и активаторов транскрипции (signal transducers and activators of transcription); - тиоредоксин окисленный; - тиоредоксин восстановленный; Введение Актуальность проблемы Механизмы оксидативного стресса интенсивно изучаются с середины 60-х годов [165] и в наше время, актуальность и острота этой проблемы не только не снизилась, но и многократно возросла. В настоящий момент мало найдётся патологических состояний где-бы не было продемонстрировано сопутствующего развития оксидативного стресса. Одним из аспектов многогранной проблемы оксидативного стресса является изучение тканьспецифичных механизмов его течения [93]. Известно, что различные органы и ткани в разной степени подвержены действию агентов, вызывающих оксидативный стресс, и демонстрируют различную устойчивость в процессе реализации этого патологического состояния [4, 159]. По мнению ряда исследователей, это связано с различным уровнем экспрессии аитиоксидантных ферментов и особенностями метаболизма различных тканей [156, 39, 235]. Особенности метаболизма различных типов клеток связаны с устойчивостью к окислительному стрессу через внутриклеточный оксилительно-восстановительный потенциал (редокс-потенциал) [211], который является производным всех биохимических реакций клетки и вычисляется через отношение концентрации восстановленного глутатиона к концентрации оксиленного глу-татиона [116]. Редокс-потенциал напрямую связан с тяжестью оксидативного стресса, чем он ниже, тем интенсивнее процессы перекисного оксиления биомолекул [217, 66]. От величины внутриклеточного редокс-потенциала и, в частности, от концентрации восстановленного глутатиона зависят также и такие процессы как, пролифереция, деление и программируемая клеточная смерть [74, 199]. Если интенсивное развитие оксидативиого стресса приводит к некрозу, то его медленное развитие запускает механизмы апоптоза [199]. В литературе имеется ряд противоречивых данных о зависимости между редокс-потенциалом, показателями перекисного окисления липидов и активностью антиоксидантных ферментов в различных тканях и типах клеток [4, 184, 211]. Понимание этих механизмов позволит целенаправленно воздействовать на внутриклеточные процессы путем активации тех или иных генов с целью смягчить последствия оксидативыого стресса и предотвратить его развитие по нежелательному сценарию, а именно воспрепятствовать запуску механизмов программируемой клеточной смерти [39, 169]. Нами была использована модель доксорубицин-индуцированного ок-сидативного стресса. Доксорубицин относится к семейству антрацикли-новых антибиотиков и применяется в онкологии. Однако, наличие у доксорубицина серьёзных кардиотоксических [218, 42, 76, 63] и, в меньшей степени, нефротоксических свойств [168, 40] существенно ограничивает его использование в онкологической практике. Существует несколько объяснений цитотоксичности доксорубицина на клеточном уровне, среди них: генерирование с участием ДОК свободных радикалов [190, 82], ингибирование ферментов репликации ДНК [219], ингибирование клеточных ферментов доксорубицинолом (веществом образующемся в результате биохимических превращений ДОК в клетке) [113], влиянием доксорубицина на механизмы внутриклеточного гомеостаза железа [167]. Однако, по мнению большинства исследователей, в нормальных тканях доксорубицин-индуцированная цитотоксичность связана, преимущественно, с образованием в клетке супероксиданион радикалов в результате редокс-циклической активности доксорубицина, что в итоге приводит к внутриклеточному оксидативиому стрессу [167, 88, 142, 91] и далее к апоптозу [43, 92]. В связи с этим, понимание механизмов токсичности доксорубицина может прояснить, как органспецифичные механизмы доксорубицин-индуцированного оксидативыого стресса, так и механизмы оксидативного стресса в целом [44]. 8 Для более глубокого понимания особенностей течения оксидативного стресса в различных тканях важно не только изучить воздействие специфического индуктора на эти ткани и изучить их ответ, но ещё более важно проанализировать роль различных участников системного клеточного ответа на оксидативный стресс. Клеточный метаболизм регулируется, в основном, за счёт влияния на экспрессию генов тех или иных белков и ферментов. К настоящему времени накоплен достаточно богатый экспериментальный материал в этой области, который позволяет подобрать узко-специфичные регуляторы экспрессии целевых генов. Исходя из целей нашего исследования и анализа литературных данных нами были выбраны вещества, способные увеличивать экспрессию генов ряда ферментов антиоксидантной защиты, а именно глутатион редук-тазы, глутатион-Б-трансферазы и НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктазы 1. Это мелатонин [180], глицин [118], унитиол [68] и эритропоетин [106]. Вместе с решением чисто теоретической задачи - изучения специфических тканевых механизмов развития оксидативного стресса, важной практической задачей является поиск фармакологических препаратов, снижающих токсичность доксорубицина. Снижение токсичности доксо-рубицина может быть достигнуто несколькими путями [52]. В частности, снижение токсичности доксорубицина способствует применение совместно с доксорубицином хелатора железа - дексразоксана [41, 221]. Хотя дек-сразоксан достаточно эффективно снимает кардиотоксические эффекты доксорубицина [103, 132], он, как оказалось, существенно снижает и эффективность доксорубицина в отношении лечения рака [117, 95]. Одним из перспективных подходов к снижению токсичности антрациклиновых антибиотиков заключаются в поиске веществ препятствующих развитию доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса [52]. Применение антиоксидантов - витамина Е, N-ацетилцистеина и пробукола хотя и демонстрировало обнадёживающие результаты в опытах на лабораторных животных [88, 191], но оказалось малоэффективным при их применении у людей [38, 44]. К препаратам, которые потенциально обладают способ- ностью препятствовать развитию оксидативиого стресса, можно отнести глицин [216], мелатонин [178, 136, 107], унитиол [31, 25] и эритропоетин [87, 98]. Цель исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение органоспецифичных механизмов оксидативного стресса, индуцированного доксорубицином, и возможностей его коррекции. . Задачи исследования 1. Изучить параметры внутриклеточной антиоксидантной защиты и показатели перекисного окисления липидов в ткани почек, печени и сердца после однократного введения доксорубицина. 2. Оценить функциональное состояние почек, печени и сердца после однократного введения доксорубицина. 3. Рассмотреть влияние экзогенных индукторов антиоксидантных ферментов на состояние системы ПОЛ-антиоксидаР1т в ткани почек, печени и сердца после однократного введения доксорубицина. 4. Изучить роль индукции ферментов антиоксидантной защиты в регуляции функционального состояния почек, печени и сердца, после однократного введения доксорубицина. 5. Оценить целесообразность применения глицина, мелатонина, уни-тиола и эритропоетина с целью снижения токсичности доксорубицина. Научная новизна исследования Автором впервые установлено, что через 24 часа после введения доксорубицина (7,5 мг/кг) интенсивность оксидативного стресса наиболее выражена в тканях почек. В ткани печени признаки оксидативного стресса выражались только в снижение концентрации восстановленного 10 глутатиона. В ткани сердечной мышцы признаков оксидативного стресса не наблюдается. Продемонстрирована связь между возникновением доксорубицин- индуцированного стресса и нарушением функций почек, что выражается в росте плазменных концентраций мочевины и креатинина. Впервые показана возможность фармакологической коррекции доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса глицином и эритропоетином. Впервые показано, что ключевым моментом нефропро-текторного действия глицина и эритропоетина является предотвращение ими доксорубицин-индуцированного снижения концентрации восстанов- ленного глутатиона в тканях почек. Продемонстрирована взаимосвязь между интенсивностью оксидативного стресса и активностью цитоплазматической глутатион редукта-зы. Показано, что увеличение активности глутатион-Б-трансферазы и НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктазы 1 не приводит к снижению интенсивности доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса Основные положения выносимые на защиту 1. В сердечной мышце оксидативный стресс через 24 часа после введения доксорубицина не возникает. 2. Система ПОЛ-антиоксидант печени и её функциональное состояние не изменяется при однократном введение доксорубицина. 3. В ткани почек на фоне однократного введения доксорубицина возникает оксидативный стресс и нарушается их функциональное состояние. 4. Применение глицина, мелатонина и эритропоетина предотвращает развитие оксидативного стресса, вызванного доксорубицином, в тка- нях почек и нормализует их функциональное состояние. 5. При развитии доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса в тканях почек определяющую роль играет изменение величины 11 внутриклеточного редокс-потенциала, обеспечиваемого глутатион-редуктазой. Ингибирование редокс-циклических реакций доксору-бицина посредством НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктазы 1 и(или) увеличение конъюгации доксорубицина с глутатионом, катализируемое ферментом глутатион-Б-трансферазой, не предотвращает развитие оксидативного стресса в ткани почек. 6. Мелатонин, глицин и эритропоетин могут быть использованы с целью снижения доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса. Научно-практическая ценность работы Показана взаимосвясь между интенсивностью оксидативного стресса и активностью цитоплазматической глутатион редуктазы в ткани почек. Установлена принципиальная возможность снижения доксорубицин-индуцированной токсичности глицином, мелатонином и эритропоетином. Полученные данные создают предпосылки для изучения возможности использования глицина, мелатонина и эритропоетина в онкологии с целью снижения токсичности антрациклиновых антибиотиков. Апробация работы Материалы, представленные в работе, докладывались на межкафедральных заседаниях сотрудников кафедр теоретического и терапевтического профиля медицинского факультета Ульяновского государственного университета, на ежегодных научно-практических межрегиональных конференциях врачей Ульяновской области (Ульяновск, 1999, 2000, 2004), международной конференции нефрологов (International society of Nephrology, Дрезден, 2004, участие в конференции поддержано грантом этого общества), XII международном конгрессе «Человек и лекарство», V-ежегодной конференции «Сердечная недостаточность 2004», международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2005). 12 Публикации По теме диссертации опубликовано 7 статей ( в том числе 4 в центральных журналах) 5 тезисов (всероссийские и международные конференции и симпозиумы). Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературных источников. Работа изложена на 168 страницах машинописного текста, включает 13 таблиц, 29 рисунков, 237 источников литературы. Глава 1 1.1 Патофизиология оксидативного стресса Более 50 лет назад свободные радикалы были обнаружены в тканях живых организмов [77]. Термин «оксидативный стресс» впервые был использован в 1966 г [165]. С тех пор проблема оксидативного стресса стала одной из центральных в биологии и медицине. В настоящее время под термином оксидативный стресс понимается остояние гомеостаза, характеризующееся увеличением содержания свободно-радикальных молекул и их продуктов [93]. Свободные радикалы - это молекулы, или отдельные атомы, имеющие неспаренные валентные электроны. Радикалы могут быть нейтральными или несущими заряд (катион-радикал и анион-радикал), короткоживу-щими или долгоживущими, что и определяет их активность [205]. Время жизни радикала зависит от множества причин. Как правило, наиболее короткоживущими являются атомы или небольшие молекулы, например, ОН* - гидроксил-радикал (радикалы принято изображать соответствующей химической формулой с точкой),О^"0 - супероксид-анион радикал [110]. Короткоживущими могут быть и большие радикальные молекулы, несущие, так называемый, центрированный радикал, в котором неспа-ренный электрон локализован около какого-либо атома этой молекулы (углерод-центрированные радикалы R—CH2—CHe—CH2... или углерод-кислород-центрированные радикалы R-OO") [144]. Свободные радикалы 14 в норме присутствуют в организме в очень низких концентрациях (10~5 - ю-9 м). Около 5% потребляемого тканями кислорода превращается в свободные радикалы. Долгоживущими или стабильными являются радикалы, в которых неспаренный электрон делокализован. Аскорбат-радикал, радикалы коэнзима Q (бензосемихинон) и токофероксил-радикал являются примерами стабильных радикалов. Стабильность центрированного радикала зависит от положения окружающих его химических групп в молекуле. Так, например, некоторые нитроксильные радикалы хотя и имеют электрон локализованный у атома кислорода, но стабильны из-за присутствия СНз-групп, которые "экранируют"радикальный центр от контакта с другими молекулами [23]. Короткоживущие свободные радикалы, обладая высокой активностью, дают начало цепным радикальным реакциям. В процессе цепной химической реакции постоянно происходит генерация свободно-радикальных молекул. На одну исчезнувшую в ходе реакции радикальную молекулу обязательно генерируется одна или более новых радикальных молекул. Именно поэтому один радикал может вызвать химическое изменение многих других не радикальных молекул, вовлекая их в цепную реакцию. В зависимости от числа вновь возникших свободных радикалов цепные радикальные реакции подразделяют на неразветвлённые, разветвлённые и цепные реакции с вырожденным разветвлением. В случае неразветвлённых цепных реакций на один исчезнувший радикал генерируется один новый. Если цепная реакция относится к классу разветвлённых, то вместо одного исчезнувшего радикала возникает два и более новых свободных радикалов; этот класс реакций характерен для неживой природы. Цепные радикальные реакции с вырожденным разветвлением характеризуются тем, что на один исчезнувший радикал генерируется один новый, но в ходе реакции дополнительно образуются промежуточные продукты, которые могут распадаться и давать жизнь 15 новым радикальным молекулам [26]. Сталкиваясь с органической молекулой, свободный радикал отрывает от неё атом водорода и превращается в валентно-насыщенную молекулу. Подвергшаяся атаке молекула сама превращается в свободный радикал. Вновь образовавшийся радикал, может оторвать атом водорода от другой молекулы, прореагировать с другим радикалом или молекулой кислорода. В последнем случае образуется пероксильный радикал R—00е, который, в свою очередь, отрывая атом водорода от другой молекулы, превращается в органический пероксид ROOH. Такой тип вырожденных цепных реакций называется процессом автоокисления углеводородов или свободно-радикальным окислением биомолекул (СРО) [32]. В биологической литературе такой процесс также называется процессом перекисного окисления липидов [1, 115]. Увеличение количества свободно-радикальных молекул приводит к возникновению оксида-тивного стресса [3]. Второй причиной оксидативгюго стресса может быть снижение эффективности антиоксидантных систем организма. Оксидативный стресс может быть локальным (при местном воспалении) и генерализованным (например, при радиоактивном облучении), умеренным (разрушению и модификации подвергаются отдельные биомолекулы) и сильным (приводит к гибели клеток или даже групп клеток) [55]. 1.1.1 Причины возникновения свободно-радикальных молекул и их основные типы Свободные радикалы могут возникать под воздействием внешних причин (радиация и ультрафиолетовое облучение), или в результате внутренних причин: при распаде нестабильных молекул (липопероксиды и гидропероксиды) [115] и механическом разрыве биополимеров [225], генерироваться в процессе химических реакций в цитоплазме [108]и в ми- 16 тохондриях [192]. Единственным окислителем, присутствующим в достаточных количе- ствах является кислород и поэтому он участвует в подавляющем боль- шинстве цепных-радикальных реакций в живой природе. Кислород может находиться в основном (триплетном состоянии - 3Sg~O2 или Ог) и возбуждённом (сииглетных состояниях - 1Ag02 и 1Sg+O2)[205]. Молекула кислорода в основном состоянии обладает парамагнитными свойствами и является бирадикалом и благодаря этому не может самопроизвольно окислять другие химические соединения. Это парадоксальное свойство молекулы кислорода связано с тем, что при образовании молекулы кислорода участвуют только по одному электрону от каждого атома, а оставшиеся электроны занимают различные молекулярные ор-битали и обладают параллельными спинами. В соответствии с законами квантовой химии, кислород может вступить в реакцию только с такой молекулой, которая также обладает двумя неспаренными электронами со спинами антипараллельными таковым у молекулы кислорода. В естественной природе пока не нашли таких молекул. Следовательно, окис-ление с участием кислорода в триплетном состоянии может протекать только в результате его последовательного одно-электронного восстановления [205, 126]. о2 ±и> о2-° ^о\- ^i 202- При поглощении энергии кислород переходит в синглетное состояние. В этом состоянии два неспаренных электрона обладают антипаралель-ными спинами, и, следовательно, снимается ограничение реакционоспо-собности молекулы кислорода в триплетном состоянии. Синглетный кислород, как правило, является инициатором СРО. Основными типами радикальных молекул, генерируемых в клетках, являются активные формы кислорода (АФК), активные формы азота (АФА) и их производные [55]. К активным формам кислорода относятся супероксид-анион радикал (О^), гидроксильный радикал (ОН°), пе- 17 роксильный радикал (ROOe) и алкоксильный радикал (ROffl). В процессе цепных реакций образуются производные активных форм кислорода, ка- м. ковыми являются пероксид водорода (Н2О2) и липопероксиды (ROOH) • [115]. К активным формам азота относится оксид азота (N0) и перокси-нитрит (0N00~) [49]. При СРО в качестве промежуточных продуктов могут возникать углерод-центрированные радикалы R° [8, 23, 32]. Ф Все радикальные молекулы и их производные можно подразделить на выполняющие физиологические функции (т. е. генерируемые в клетках для определенных целей), имеющие патологическое значение (возникающие в ходе цепных радикальных реакций) и смешанные [93]. Но при ^ гиперпродукции любых радикальных молекул возникает оксидативный стресс и происходят необратимые повреждения биомолекул [126, 205]. Наибольшее внимание на современном этапе привлекают четыре источника свободных радикалов: 1) митохондриальная дыхательная цепь; 2) пероксисомальный метаболизм жирных кислот; 3) реакции с участием цитохрома Р450; 4) реакции с участием мембранной НАД(Ф)Н оксидазы. Комплексы I (НАДН-дегидрогеназа) и III (цитохром с-редуктаза) ми-тохондрий являются основным источником супероксиданион радикала в нефагоцитирующих клетках, который образуется в результате одно-электронного восстановления кислорода [192]. Подсчитано, что митохондрии могут превращать до 2% поглощенного кислорода в супероксид- ф анион радикал [237]. Кроме митохондриальных комплексов I и III, потенциальными источниками супероксид-анион радикала являются ферменты метаболизма арахидоновой кислоты (липооксигеназа и циклоок-сигеназа), ксантиноксидазы, цитоплазматические изоформы НАД(Ф)Н-оксидаз, цитохром Р45о~оксидазы [120, 65]. Вклад каждой ферментной системы в общую продукцию супероксид-анион радикала зависит от типа ткани и состояния клеток. Например, вклад семейства ксантин-оксидаз в продукцию О^~ начинает ощущаться только при недостатке молибдена, который является кофактором этого фермента [209]. Вторым по важности источником производных АФК являются пе-

Список литературы

Цена, в рублях: (при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)	1425

Скачать бесплатно	25125.doc

Найти готовую работу

ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:

Связаться

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ

15.04.24 Задачи, условия и этапы организации экспериментальной работы

15.04.24 Критерии качества преподавания

15.04.24 Категория нормы в обучающей деятельности

Архив материала для курсовых и дипломных работ

Ссылки:

Счетчики:

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.