У нас уже 22592 рефератов, курсовых и дипломных работ
Заказать диплом, курсовую, диссертацию


Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Понравилось
Не понравилось





Книга жалоб
и предложений


 






Название Изучение антимикробный пептидов из целомоцитов пескожила Arenicola marina L
Количество страниц 150
ВУЗ МГИУ
Год сдачи 2010
Бесплатно Скачать 25137.doc 
Содержание ВВЕДЕНИЕ...5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...10

1.1 Краткая история вопроса... 10

1.2 Структурное разнообразие АМП... 12

1.3 Молекулярная биология антибиотических пептидов... 27

1.4 Механизмы антимикробного действия антибиотических пептидов... 36

1.5. К вопросу о разнообразии антимикробных пептидов... 50

1.6 Функциональные свойства АМП, отличные от антимикробной активности... 52

1.7 Прикладные исследования... 55

1.8 О состоянии современных знаний об АМП у разных групп животных... 56

1.9 Заключение... 59

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...61

2.1 Получение биологического материала... 61

2.2 Цитохимические методы... 62

2.3 Экстрагирование катионных пептидов... 63

2.4 Методы электрофореза... 63

2.5 Методы окраски пептидов в полиакриламидных гелях... 65

2.6 Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография... 66

2.7 Методы определения концентраций пептидов... 66

2.8 Методы определения дисульфидных связей в молекулах пептидов... 67

2.9 Методы определения молекулярной массы пептидов... 68

2.10 Процедура переноса пептидов на PVDF мембрану... 69

2.12 Определение аминокислотной последовательности пептидов... 69

2.13 Методы определения антимикробной активности пептидов... 70

2.14 Определение воздействия пептида на проницаемость внутренней мембраны E.coli... 74

2.15 Метод определения гемолитической активности пептидов... 76

2.16 Метод оценки хемотаксической активности целомоцитов пескожила... 77

2.17 Статистическая обработка результатов... 77

2.18 Использованные для сравнительных исследований препараты антимикробных пептидов были получены из следующих источников:... 78

2.19 Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей... 78

4

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...79

3.1 Анализ препаратов... 79

3.2 Выделение и очистка антимикробных пептидов из целомоцитов пескожила... 85

3.2.1 Выделение и очистка ареницинов... 85

3.2.2 Определение аминокислотной последовательности ареницинов... 91

3.2.3 Выделение и очистка других катионных антимикробных пептидов... 91

3.4 Изучение функциональных свойств ареницина-1... 102

3.4.1 Исследование антимикробной активности in vitro... 102

3.4.1.1 Изучение влияния различных условий среды на проявляемую ареницином антимикробную активность... 104

4. 3. 2 Изучение влияния ареницина-1 на изменение проницаемости цитоплазматической мембраны грам-отрицательной бактерии Escherichia coli ML-35p... 110

4.3.3 Изучение гемолитической активности ареницинов... 115

4.3.4 Взаимодействие ареницина-1 с лизоцимом человека... 118

4.3.5 Изучение способности арницина-1 вызывать направленную миграцию целомоцитов пескожила... 119

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...121

4.1 Анализ препаратов целомоцитов... 121

4.2 Выделение, очистка и определение первичной структуры ареницинов... 122

4.3 Выделение, очистка и характеристика других антимикробных пептидов из

целомоцитов пескожила... 128

4. 4 Функциональные свойства ареницина-1... 130

4.4.1 Антимикробная активность in vitro... 130

4. 4. 2 Влияние ареницина-1 на изменение проницаемости цитоплазматической мембраны грам-отрицательной бактерии Escherichia coli ML-35p... 136

4.4.3 Гемолитическая активность ареницина-1... 140

4.4.4 Взаимодействие ареницина-1 с лизоцимом... 142

4.4.5 Хемотаксическая активность ареницина-1 в отношении целомоцитов пескожила 145

5. ВЫВОДЫ...148

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ... 150



Введение



ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Микроорганизмы представляют собой постоянную угрозу для всех многоклеточных животных, которые сохраняют способность к самоподдержанию и самовоспроизведению лишь постольку, поскольку могут противостоять агрессивному потенциалу окружающей их микробной флоры. Необходимым условием эволюции всего живого являлось развитие защитных механизмов, т.е. способности противостоять инфекциям - иммунитета.

Иммунитет представляет собой совокупность факторов, способных распознавать, изолировать, уничтожать или ограничивать экспансию чужеродных элементов. Уже в середине 20-го века иммунологи четко различали иммунитет естественный и приобретенный. Первый из них понимали как «невосприимчивость, обусловленную врожденными биологическими особенностями, присущими данному виду, как наследуемый видовой признак» (цит. По А. Зильберу). Приобретенный иммунитет рассматривали как резистентность к инфекции, возникшую в течение индивидуальной жизни вследствие контакта с потенциальным патогеном. В дальнейшем для обозначения естественного иммунитета были предложены термины «врожденный» и «неспецифический». Приобретенный иммунитет определили как «специфический» или «адаптивный».

У беспозвоночных и древнейших позвоночных животных (круглоротых) защиту от инфекций и паразитарных инвазий обеспечивает совокупность факторов врожденного иммунитета.

У позвоночных животных в дополнение к врожденной появилась система иммунитета адаптивного, основными чертами которого являются индуцибельность, высокая специфичность, формирование иммунологической «памяти». Врожденный иммунитет обеспечивает защиту на первых этапах взаимодействия организма с патогенами и играет важную роль в модуляции и регулировании дальнейших адаптивных процессов. Именно с помощью механизмов врожденного иммунитета осуществляется контроль над уровнем естественной микрофлоры организма.

В последнее время все большее значение приобретает изучение механизмов врожденного иммунитета. Особый интерес представляет группа беспозвоночных животных. Успешное выживание в среде, изобилующей микроорганизмами

6

свидетельствует об эффективности функционирования их защитных систем. При этом многие процессы, из которых слагается сложнейший иммунный ответ у позвоночных, у беспозвоночных нередко представлены в более простой и доступной для анализа форме.

Врожденный иммунитет складывается из клеточного и гуморального звеньев. Наиболее распространенными и универсальными являются механизмы фагоцитоза и агрегации клеток полости тела, гемоцитов или целомоцитов у беспозвоночных, и нейтрофилов и макрофагов у млекопитающих. Гуморальные факторы представлены белками плазмы крови или целомической жидкости (Кокряков В.Н., 1999; Хаитов, 2000; Климович В.Б., 2002).

В течение последних 20 лет стало ясно, что традиционное представление об эффекторных молекулах врожденного иммунитета является неполным без учета роли катионных антимикробных пептидов (АМГТ). Открытие этих веществ вызвало очень большой интерес исследователей во всем мире, и накопленные к настоящему моменту сведения позволяют сделать вывод о том, что антибиотические пептиды являются ведущими молекулярными компонентами системы врожденного иммунитета. Эти вещества являются древнейшими факторами защиты всех видов живых организмов и обнаруживаются в органах и тканях, для которых наиболее вероятен контакт с внешним патогеном, (поверхностные и слизистые эпителии, гранулы фагоцитарных клеток, гемолимфа и целомическая жидкость), что косвенно свидетельствует в пользу их участия в обеспечении неспецифической антимикробной резистентности (Кокряков, 1999).

К АМП относят группу пептидо^ обладающих следующими свойствами: они положительно заряжены (минимальный положительный заряд +2, чаще +4,+5, в зависимости от содержания аминокислотных остатков лизина, аргинина и гистидина), имеют низкую молекулярную массу (не более ЮкДа) и формируют такую третичную структуру, в которой гидрофобные и гидрофильные боковые радикалы аминокислот пространственно разобщены, т.е. молекула является амфипатической (важную роль в стабилизации подобной структуры играют внутримолекулярные дисульфидные связи). Эти свойства лежат в основе механизма действия АМП на клетки патогенов. Действие подавляющего большинства АМП направлено на дестабилизацию и в конечном итоге разрушение клеточной мембраны, что вызывает серьезные системные повреждения, несовместимые с жизнедеятельностью микробной клетки.

7

Помимо трех указанных выше общих качеств АМП демонстрируют большое разнообразие первичных и надпервичных структур и имеют разный характер функциональной активности.

Многие АМП проявляют высокую активность против грам-отрицательных и грам-положительных бактерий, грибов, некоторых оболочечных вирусов (дефенсины), некоторые цитотоксичны в отношении эукариотических клеток. Другие пептиды имеют более ограниченный спектр действия (цекропины, профенины). Даже небольшие изменения в структуре молекулы могут оказывать значительное влияние на ее активность. Понимание соответствия между структурой и активностью является одним из важнейших направлений исследований. В дополнение к основной функции умерщвления микроорганизмов, некоторые изученные антимикробные пептиды (в частности дефенсины человека) обладают целым спектром функциональных свойств, свидетельствующих об их участии во взаимодействии систем врожденного и приобретенного иммунитета (хемотаксическим, способностью к модуляции продукции цитокинов, антисептическим, кортикостатическим и др.) (Кокряков, 1999; Gennaro, Zanetti, 2000; Yang etal., 2004).

Показана возможная роль и в других физиологических процессах (атерогенезе, заживлении ран и свертывании крови (а-дефенсины) (Raj, Dentino, 2002)), есть данные о воздействии дефенсинов человека и насекомых на ионные каналы (MacLeod et al., 1991; Bateman et al, 1996).

Все это указывает на многофункциональность антимикробных пептидов, реализация которой может в значительной степени определять эффективность защитных реакций организма (Кокряков, 1999).

Необходимо учитывать, что in vivo АМП действуют кооперативно друг с другом и другими факторами системы врожденного иммунитета, обеспечивая наиболее эффективную защитную реакцию организма-хозяина.

Хотя исследования АМП животных проводятся уже более 40 лет, видовой состав организмов, которые были изучены в этой области, составляет ничтожную часть от общего числа известных видов.

Для понимания закономерностей эволюции механизмов противоинфекционной защиты, необходимо дальнейшее накопление знаний о структуре и функциональных свойствах АМП у разных видов живых организмов. С точки зрения сравнительной биохимии представляет интерес изучение АМП у представителей ключевых в эволюционном плане групп животных.

8

Поиск новых АМП важен не только с фундаментальной, но и с практической точки зрения. Как антимикробные агенты АМП весьма перспективны для разработки на их основе новых лекарственных препаратов, «антибиотиков животного происхождения». Они лишены многих недостатков свойственных традиционно применяемым антибиотикам (против их действия редко вырабатывается резистентность, не развивается эндотоксемия), и представляют собой сформировавшиеся в процессе эволюции молекулярные матрицы, естественные для организмов (Кокряков, 1999; Gennaro, Zanetti, 2000; Gallo et al., 2002; Bevins, 2003; Yang et al., 2004).

Выбор в качестве объекта исследований представителя класса многощетинковых червей кл. Polychaeta (т. Annelida) определялся тем, что, в соответствии с современными представлениями, полихеты являются ключевой группой в эволюции трохофорных животных, давшей начало моллюскам и членистоногим. Антимикробные пептиды у этих животных еще не были обнаружены другими исследователями, хотя были описаны другие (высокомолекулярные) белковые антимикробные факторы (Cooper et al., 2002).

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы было выявление и изучение структурных и функциональных свойств антимикробных пептидов из целомоцитов пескожила Arenicola marina L.. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Поиск, идентификация и очистка антимикробных пептидов;

2. Изучение физико-химических свойств, определение первичной структуры выделенных пептидов;

3. Изучение функциональных свойств выявленных пептидов.

Научная новизна

В работе впервые было проведено комплексное изучение антимикробных пептидов

целомоцитов пескожила и показано, что они обладают целым спектром

антимикробных пептидов.

Был выявлен и очищен до гомогенного состояния ряд антимикробных пептидов.

Среди выделенных пептидов было охарактеризовано две изоформы новых

антимикробных пептидов названных нами ареницинами, которые можно отнести к

новому структурному семейству.

9

Получены данные, характеризующие антимикробную и гемолитическую активность ареницина-1.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Целомоциты пескожила содержат целый ряд катионных антимикробных пептидов Из целомоцитов выделено в чистом виде 11 антимикробных пептидов. Среди всех охарактеризованных антимикробных пептидов особый интерес представляют новые антимикробные пептиды ареницины. Ареницины являются пептидами с уникальной структурой, принадлежащей к новому структурному семейству.

2. Ареницин-1 является эффективным антибиотическим агентом с широким спектром действия на микроорганизмы, причем его антимикробная активность остается стабильной в широком диапазоне условий. Как и у подавляющего большинства антимикробных пептидов бактерицидное действие ареницина-1 является следствием взаимодействий молекулы пептида с цитоплазматической мембраной клетки. По эффективности микробоцидного действия ареницин-1 сравним с самыми сильными пептидными антибиотиками. Несмотря на присущую ареницину способность вызывать гемолиз эритроцитов, гемолитическая активность начинает проявляться при высоких концентрациях пептида, намного превышающих минимальные ингибирующие концентрации, установленные в отношении микроорганизмов.

10

1. Обзор литературы

1.1 Краткая история вопроса

История изучения клеточно-молекулярных механизмов резистентное™ человека и животных к инфекции восходит к работам Пастера, который обосновал микробную теорию инфекционных заболеваний, и Мечникова, описавшего явление фагоцитоза микробов, проникших через поврежденный эпителий, подвижными клетками, и выдвинувшего фагоцитарную теорию иммунитета (1883г.). Им же была сформулирована концепция о цитазах — бактерицидных соединениях лейкоцитарного происхождения, обеспечивающих инактивацию и переваривание фагоцитированных микроорганизмов.

Антибиотические пептиды впервые были обнаружены в азурофильных гранулах нейтрофилов морской свинки (Zeya, Spitznagel, 1963), тогда их обозначили как группу лизосомных катионных белков, позднее они были секвенированы и названы дефенсинами (англ. defence-защита) (Ganz et al.,1985).

Изучение молекулярных основ врожденного иммунитета у насекомых привело к открытию в гемолимфе куколок Hyalophora cecropia (гигантского шелкопряда) катионных антимикробных пептидов (Hultmark et al.,1980; Steiner et al., 1981), которым потом было дано название цекропинов.

Дефенсин-подобные молекулы были найдены у насекомых, в 1989 французские исследователи выделили из гемолимфы личинки падальной мухи Phormia terranovae два АМП (формицины А и В), которые имели частичное структурное сходство с дефенсином NP-1 из альвеолярных макрофагов кролика (Lambert et al.,1989). Дальнейшие исследования подтвердили, что АМП широко распространены в природе и присутствуют практически у всех изученных в этом направлении видов организмов, включая бактерии, простейших, грибы, растения, кишечно-полостных, моллюсков, иглокожих, оболочников, ракообразных, насекомых, амфибий, птиц и млекопитающих. Причем в одном организме может содержаться от 1 до нескольких десятков (38 у крупного рогатого скота) различных антимикробных пептидов, принадлежащих как к разным структурным классам, так и являющихся вариациями одной структуры (Hancock, Diamond, 2000).

11

В 1987г. Заслоф выделил из кожи лягушки Xenopus laevis магейнины, которые активны in vitro против грам-положительных, грам-отрицательных бактерий, грибков и простейших (Zasloffet al.,1987).

В 1993 г. из лейкоцитов свиньи были выделены протегрины (PG-1,2,3). Они состоят всего из 16-18 аминокислотных остатков, с двумя внутримолекулярными дисульфидными мостиками (Kokryakovetal., 1993). В условиях in vitro протегрины проявляют активность против широкого спектра микроорганизмов. В начале 1990х годов было открыто семейство кателицидинов, ключевым моментом в истории их открытия послужило клонирование кДНК Вас5 (пептида, ранее выделенного из нейтрофилов быка). К удивлению исследователей, вместе с к ДНК для этого пептида амплифицировались другие кДНК последовательности, каждая из которых содержала одинаковый консервативный участок, кодирующий N-конец пептида и вариабельный участок соответствующий ранее описанным бычьим АМП. Вскоре с помощью метода RACE (быстрой амплификации концов кДНК), множество подобных пептидов было обнаружено у разных видов млекопитающих. Упомянутые выше протегрины тоже относятся к этому семейству. Очевидно, что все эти пептиды эволюционно родственны, несмотря на огромное разнообразие эффекторных доменов. Консервативный участок оказался на 70% гомологичен

белку (И кДа) из лейкоцитов свиньи «кателину», ингибитору катепсина L. Для обозначения этого семейства АМП был введен термин кателицидины (Zanetti et al, 1995).

В 1997г. в лаборатории проф. Лерера (США) были выделены цекропин-подобные пептиды стиелины из гемоцитов асцидии Styela clava (Lee et al., 1997).

В 1999г. группой проф. Селстеда было описано новое семейство дефенсинов из лейкоцитов макаки-резус - 0-дефенсины (Tang et al, 1999). Еще в 1995 г. в базе данных содержалось только 50

аминокислотных последовательностей антимикробных пептидов. К настоящему

...Ill

80 SI 82 83 В4 8S вв 87 8В 69 90 91 92 93 94 96 BS 97 Яй 99 ОО О1

Year

100

90

€0 81 82 83 84 85 86 87 68 69 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 Year

Рис1. Количество последовательностей в

базе данных (http:/Avww.bbem.univ.trieste.itA«

А- общее количество последовательностей

АМП;

Б-количество новых последовательностей в

год.

12

моменту охарактеризовано более 1000 АМП (Bulet et al., 2004) (и эта цифра постоянно увеличивается (рис.1)), выделенных из различных видов позвоночных и беспозвоночных животных, растений, простейших и даже бактерий (хотя в последнем случае они содержат в своем составе много неканонических и модифицированных аминокислот).

Изучение АМП в основном развивается по двум главным направлениям. Первое представлено исследованиями АМП млекопитающих, и особенно человека, которые представляют собой актуальную медико-биологическую проблему. Второе мощное направление связано с изучением врожденного иммунитета насекомых, которые являются самым многочисленным по количеству видов классом животных на земле, несмотря на отсутствие у них механизмов приобретенного иммунитета. Как следствие, больше 50% известных АМП было описано у насекомых и около 40% у млекопитающих. Данные по другим группам живых организмов имеют несистематический характер. Прежде чем перейти к обзору данных, касающихся различных функциональных свойств АМП, имеет смысл кратко рассмотреть структурные особенности этих молекул.

1.2 Структурное разнообразие АМП.

Построить естественную классификацию антимикробных пептидов, основанную на общности происхождения структур, пока не удается, т.к. несмотря на все возрастающее число открываемых пептидов, фактический материал еще далеко недостаточен. Слишком мал список изученных в этом отношении видов живых организмов, чтобы делать обобщения» касающиеся больших систематических групп. Требуется сравнение спектров антимикробных пептидов из разных видов, принадлежащих к разным таксонам, а также изучение специфичности их действия в отношении спектра микробов, контактирующих с данным видом организмов в естественных условиях.

В 1996 г. Боман предложил классификацию, основанную на известной или предсказуемой третичной структуре (Boman, 1996).

Большое значение в этой системе придавалось наличию, количеству и аранжировке дисульфидных связей в молекуле пептида. В соответствии с ней выделялось пять структурных классов. Позже были предприняты попытки упростить систему до трех

13

классов, но такое упрощение не отражало всей полноты вновь описываемых структур. К настоящему моменту опять говорят о пяти группах АМП (Boman, 2000). Надо отметить, что данная система является искусственной, позволяющей формально систематизировать накопленные данные.

1.2.1 Самая большая группа на настоящий момент (290 пептидов) представлена пептидами, формирующими амфипатические ct-спирали в липидном окружении, но обычно неупорядоченными в водных растворах. Спиральная структура часто представлена в виде спираль-поворот-спираль, где первые 9-16 аминокислотных остатков формируют гидрофильный спиральный участок рядом с N-концом, далее 2-4 остатка (глицин и/или пролин) участвуют в повороте и следующие 11-14 аминокислот образуют гидрофобную спираль у С-конца (Holak et al., 1988). Это линейные молекулы, не содержащие цистеина.

Сюда относят цекропины, первоначально выделенные из иммунизированной гемолимфы куколки Hyalophora cecropia. Последующие исследования показали наличие таких пептидов в гемолимфе многих видов насекомых (Handuca sexta, Samia cyntia, Drosophila sp. и т.д.). В соответствии с аминокислотной последовательностью выделяют три вида цекропинов А, В и D. С-концевые аминокислотные остатки известных цекропинов насекомых амидированы (Boman, 1996) (Рис.2)ь

В 1997г. были выделены и секвенированы цекропинподобные пептиды из гемоцитов асцидии Styela clava, относящейся к подтипу оболочников (Lee et al., 1997a). Факт обнаружения пептидов этого класса в таких эволюционно отдаленных группах животных свидетельствует как об их древнем происхождении, так и особой функциональной значимости в обеспечении резистентно ста к инфекции.

In vitro цекропины А и В очень активны против грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, тогда, как цекропин D только против грам-отрицательных (Boman , Hultmark, 1987). Более оснбвные представители семейства цекропинов (А и В) обладают повышенной антимикробной активностью по сравнению с менее катионным цекропином D, в молекуле которого на 3 положительных заряда меньше (Boman, 1991). Изученные пептиды обладают низкой цитотоксичностью в отношении эукариотических клеток.

14

ЦекропинА GWLKKIGKKI ERVGQHTRDA TI-QGLGIAQ QAANVAATAR* (Drosophila m.)

ЦекропинВ GWLRKLGKKI ERIGQHTRDA SI-QVLGIAQ QAANVAATAR* (Drosophila m.)

ЦекропинЭ W—NPFKEL EKVGQRVRDA VISAGPAVAT VAQATALAK* (Hyalophora cecropia)

Рис. 2 Первичная структура цекропинов ( цит. по В.Кокрякову, 1999).

*--амидированные аминокислотные остатки.

Уникальные пептидные антибиотики найдены в репродуктивных органах некоторых насекомых. У Drosophila вырабатывается андропин (Boman , Hultmark, 1987). Он состоит из 32 аминокислот, формирующих две а-спирали, его ген примыкает к кластеру генов, кодирующих цекропины. Этот ген активируется при спаривании, а не при инфекционном заражении, и экспрессируется только у зрелых самцов. Из репродуктивных органов самки Ceratus capitata были выделены два пептида (цератотоксины). Они обладают большой структурной гомологией с цекропинами и проявляют антибактериальную и гемолитическую активность (Marchini et al., 1993,). В коже амфибий находится большое количество желез, вырабатывающих биологически-активные пептиды. В 1987г. Zasloff выделил из кожи лягушки Xenopus laevis магейнины, которые активны in vitro против грам-положительных, грам-отрицательных бактерий, грибков и простейших (Zasloff et al.,1987). В микробоцидных дозах эти пептиды не цитотоксичны в отношении эритроцитов и лимфоцитов, однако, к их литическому действию оказались повышенно чувствительны трансформированные (опухолевые) клетки.

Видимо магейнины оказались уникальными для Xenopus, т.к. у других видов амфибий, найдены другие структурные группы пептидов, например, бомбинины из секретов кожи азиатской жабы Bombina orientalis (Gibson et al., 1991). Цекропины и магейнины проявляют активность против эукариотических одноклеточных паразитов (p. Plasmodium и p. Leishmania) . Цекропин является пока единственным пептидом, воздействующим на многоклеточного паразита Brugia pahangi (нематоду, вызывающую филляриоз человека) (обзор Vizioli, Salzet, 2002). У млекопитающих пептиды этого класса обнаруживаются среди семейства кателицидинов. Это единственный кателицидин человека LL-37/hCAP18 (Cowland et al., 1995), а также BMAPs, PMAPs, eCATHs и CRAMP, кателицидины коров,

15

свиньи, лошади, кролика и мыши, соответственно (обзор Gennaro, Zannetti, 2000). Эти пептиды обладают широким спектром антимикробной активности относительно грамположительных, грамотрицательных бактерий и грибов, некоторые (LL-37, ВМАР-28) цитотоксичны относительно эукариотных клеток (эритроцитов, нормальных и опухолевых клеток).

1.2.2 Пептиды, образующие антипараллельные р-слои.

Такой тип структуры имеют молекулы, содержащие от двух и более внутримолекулярных дисульфидных связей (258 известных последовательностей) (http://www.bbcm.univ.trieste.it/). 1.2.2.1 Пептиды, содержащие 2 дисульфидные связи.

Из лейкоцитов свиньи были выделены протегрины (PG-1,2,3), относящиеся к семейству кателицидинов. Они состоят всего из 16-18 аминокислотных остатков, с двумя дисульфидными мостиками (Kokryakov et al.,1993). В условиях in vitro протегрины проявляют активность против широкого спектра микроорганизмов (грам-положительных, грам-отрицательных бактерий, грибов, вирусов иммунодефицита человека) (Tamamura et al.,1995). Небольшая молекулярная масса делает эти пептиды перспективным объектом для химического синтеза и фармакологических исследований.

Третичная структура PG-1 сходна с таковой тахиплезина и полифемузина — АП из гемоцитов подковообразных крабов Tachypleus tridentatus (Nakamura et al.,1988) и Limulus polyphemus (Miyata et al.,1989), которые являются представителями древней группы беспозвоночных животных, относящихся к классу Xiphosura (Мечехвосты), типа Arthropoda (Членистоногие). Причем структурная гомология сравниваемых пептидов на уровне первичной последовательности относительна, т.к. расположение четырех цистеинов, образующих 2 дисульфидных мостика и большинства идентичных аминокислотных остатков не совпадают. В то же время аранжировка их S-S связей и общая третичная структура ( классическая антипараллельная р-шпилька) у них идентичны (Fahner et al, 1996). Пептид андроктонин, еще более гомологичный по своей структуре тахиплезину был выделен из гемолимфы скорпиона Androctonus australis (Ehret-Sabatier et al.,1996). (рис. З)

16

PG-1 RGGRLC—YCRRRFCVCVGR

T-l K—WC—FRVC—YRGICYRRCR P-l RRWC—FRVC—YRGICYRKCR A RSVCRQIKICRRRGGCYYKCTNRPY

Рис. 3 Первичная структура протегрина (PG-1), тахиплезина(Т-1), полифемузина (Р-1), андроктонина(А), (цит. по В. Кокрякову, 1999).

1.2.2.2 Пептиды с 3-мя дисульфидными связями (дефенсины).

К этому классу относится наиболее распространенная и многочисленная группа из известных антимикробных пептидов — дефенсины. Это название стало даже в какой-то степени нарицательным для обозначения всех вообще антимикробных пептидов.

Дефенсины участвуют в защите организма от микробных инвазий у млекопитающих, насекомых и растений, такая широкая распространенность дефенсин-подобных молекул свидетельсьтвует об их древнем происхождении и функциональной значимости.

Дефенсины позвоночных содержат от 29 до 40 аминокислотных остатков, включающих шесть инвариантных остатков цистеина, которые образуют 3 внутримолекулярные дисульфидные связи. По расположению цистеинов и замыканию S--S связей различают а-, р- и 0- дефенсины.

Первыми были открыты а-дефенсины или «классические» дефенсины, для них характерна локализация в гранулах фагоцитарных клеток млекопитающих. У человека (HNP1-4) и кролика (NP1-5) эти полипептиды локализованы преимущественно в азурофильных гранулах нейтрофилов, хотя в следовых количествах представлены и в специфических и составляют до 5-7% от общего содержания белка нейтрофильных гранулоцитов человека (Rice et al., 1987) и до 8% у кролика (Zeya, Spitznagel, 1966). Обладая широким спектром антимикробного действия, они обеспечивают эффективность стадии фагоцитоза, ответственную за инактивацию (киллинг) микроорганизмов. Нейтрофильные гранулоциты являются не единственными клетками организма человека и млекопитающих, содержащими дефенсины - еще в начале 80-х годов два компонента кроличьих дефенсинов были выявлены в альвеолярных макрофагах (МСР-1,2) (Selsted et al.,1993). Позднее криптидины (дефенсины мыши) были обнаружены в клетках Панета,

17

расположенных в криптах слизистой тонкого кишечника (Eisenhauer et al., 1992). Доказано присутствие дефенсинов (HD5,6) в клетках эпителия тонкой кишки человека (Jones, Bevins,1992).

а- дефенсины состоят примерно из 26-36 аминокислот, формируют антипараллельную (3- структуру, стабилизированную тремя дисульфидными мостиками 1:6, 2:4, 3:5 (цистеины С2 : СЗО, С4 : С19, С9 : С29), связь 1:6 придает молекуле квази-циклический характер. По данным рентгено-структурного анализа дефенсин человека HNP-3 представляет собой эллипсоидную молекулу размером 26x15x15 А, состоящую из трех антипараллельных р-тяжей. В составе молекулы имеются два инвариантных остатка -аргинин( 15) и глутаминовая кислота(13), формирующих солевой мостик. В растворе а-дефенсины человека образуют димеры (голова к хвосту), стабилизированные водородными связями и двумя молекулами воды (Hill et al.,1991). Интересно, что а-дефенсины кролика не обладают такой способностью и взаимодействуют с искусственными билипидными слоями инач^чем а-дефенсины человека (Hristova et al., 1996). Р- Дефенсины состоят из 38-42 аминокислот, также имеют 6 консервативных остатков цистеина, но отличаются по их положению и характеру замыкания дисульфидных мостиков (1:5, 2:4, 3:6). Они содержат инвариантный остаток пролина, отсутствующий у а-дефенсинов и имеют другую структуру предшественника, однако формируют сходную пространственную структуру (Рис.4), ос-дефенсины

NP-1 VVCACRRALCLPRERRAGFCRIRGRIHPLCCRR

HNP-1 ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC

Р-дефенсины

BNBD-1 DFASCHTTNGGICLPNRCPGHMIQIGICFRPRVKCCRS W ТАР NPVSCVRNKGICVPIRCPGSMKQIGTCVGRAVKCCRKK

Gal-1 GRKSDCFRKSGFCAFLKCPSLTLISGKCSRFYL- CCKRIW Рис.4 Первичные структуры а- и Р-дефенсинов позвоночных животных. NP-1 из нейтрофилов кролика, HNP-1 из нейтрофилов человека, BNBD-1 из нейтрофилов крупного рогатого скота, ТАР из эпителия трахеи крупного рогатого скота, Gal-1 из гетерофилов кур (цит. по В. Кокрякову, 1999).

Список литературы
Цена, в рублях:

(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)
1425
Скачать бесплатно 25137.doc 





Найти готовую работу


ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:


Связаться

Доставка любой диссертации из России и Украины



Ссылки:

Выполнение и продажа диссертаций, бесплатный каталог статей и авторефератов

Счетчики:


© 2006-2016. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.