У нас уже 22591 рефератов, курсовых и дипломных работ
Заказать диплом, курсовую, диссертацию


Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Понравилось
Не понравилось





Книга жалоб
и предложений


 






Название Фотосинтетический аппарат растений при воздействии различный неблагоприятнык факторов
Количество страниц 150
ВУЗ МГИУ
Год сдачи 2010
Бесплатно Скачать 25150.doc 
Содержание Содержание
Введение...4

Глава 1. Обзор литературы...6

1.1. Роль фотосинтетических пигментов в защитных механизмах фотосинтетического

аппарата растений...6

i 1.2. Фотосинтетический аппарат растений в условиях природного стресса...20

^ 1.2.1. Фотосинтетический аппарат хвойных растений при переходе к зиме

и в условиях зимнего стресса (низкая температура и высокая освещенность)...20

1.2.2. Фотосинтетический аппарат травянистых растений при действии закаливающих и повреждающих температур...25

1.3. Фотосинтетический аппарат растений в условиях антропогенного стресса...31

1.3.1. Фотосинтетический аппарат хвойных растений в условиях промышленного загрязнения и на урбанизированных территориях...31

1.3.2. Фотосинтетический аппарат Festucapratensis Huds.

на урбанизированных территориях...34

1.4. Мутанты в изучении фотосинтетического аппарата растений

в условиях стресса...35

Глава 2. Объекты и методы исследования...43

2.1. Объекты исследования...43

2.2. Краткая характеристика районов исследования...44

2.3. Схемы экспериментов...46

2.4. Методы исследования...49

2.4.1. Биометрический метод...49

2.4.2. Определение пигментного состава...49

2.4.3. Определение интенсивности фотосинтеза по выделению кислорода...50

2.4.4. Определение параметров флуоресценции...51

2.4.5. Определение активности электронного транспорта фотосистем I и II...52

2.4.6. Статистическая обработка данных...53

Глава 3. Результаты и обсуждение...54

3.1. Фотосинтетический аппарат хвойных растений под воздействием различных

неблагоприятных факторов...54

3.1.1. Состояние фотосинтетического аппарата Picea abies L. в условиях зимнего стресса (условия низкой температуры и высокой освещенности)...54

3.1.2. Состояние фотосинтетического аппарата Picea abies L. и Pinus sylvestis L. в условиях антропогенного загрязнения...60

3.1.2.1. Состояние фотосинтетического аппарата Picea abies L. и Pinus sylvestis L. в зоне действия Мончегорского комбината...60

3.1.2.2. Фотосинтетический аппарат Pinus sylvestris L. в зоне действия Костомукшского ГОКа...71

3.1.2.3. Состояние фотосинтетического аппарата Picea abies L.

на территории г. Петрозаводска...74

3.2. Фотосинтетический аппарат злаковых растений под воздействием различных неблагоприятных факторов...80

3.2.1. Фотосинтетический аппарат Triticum aestivum L. cult. Pomo

под воздействием различной температуры и освещенности...80

3.2.1.1. Низкотемпературное закаливание...80

3.2.1.2. Высокотемпературное закаливание...81

3.2.1.3. Действие отрицательных температур в условиях различной освещенности...83

3.2.2. Состояние фотосинтетического аппарата естественных популяций Festuca pratensis Huds. на территории г. Петрозаводска...87

3.2.3. Состояние пигментного аппарата Festuca pratensis Huds., подвергнутой воздействию радиации...90

3.2.4. Характеристика фотосинтетического аппарата хлорофиллдефектных мутантов Festuca pratensis Huds...91

3.2.4.1.Определение пигментного состава и композиции каротиноидов в

условиях оптимума, температурной нагрузки и в ходе восстановления...91

3.2.4.2. Изучение активности фотосинтетического аппарата в условиях

температурного оптимума и нагрузки...101

Заключение...115

Выводы...120

Список литературы...122

Приложение...150

Введение



Введение

Актуальность. Фотоингибирование у растений возникает в условиях, когда поглощение световой энергии хлорофиллом превышает ее использование в фотосинтезе. "Избыточное" освещение может быть как при высокой, так и при низкой освещенности в условиях стрессов, снижающих активность фотосинтеза (недостаток кислорода, неблагоприятная температура, загрязнение) (Winter, Demmig, 1987; Маслова и др., 1996; Smirnoff, 1996; Ciorapi et al., 1997; Montane, 1998; Liu et al., 2001; Tsonev et al., 2003 и др.). Интерес к механизмам защиты фотосинтетического аппарата растений от повреждений, возникающих вследствие действия неблагоприятных факторов, огромен, особенно это касается функционирования антиоксидантных систем (Krinsky, 1966; Lichtenthaler, Schindler, 1992; Schubert et al., 1994; Tausz et al., 1999, 2001; Baroli et al., 2002; Miiller-Moulle et al., 2003 и др.). Одной из таких систем является открытый в 1957 г. виолаксантиновый цикл (Сапожников и др., 1957), функциональной активности которого посвящено большое число обзорных работ (Sieferman-Harms, 1977; Yamamoto, 1979; Hager, 1980; Demmig-Adams, Adams, 1992; Pfumdel, Bilger, 1994; Маслова и др., 1996; Gilmore, 1997; Young et al., 1997; Niyogi et al., 1998, 1999; Havaux, Niyogi, 1999; Demmig-Adams et al., 1999; Frank, 2000; Gilmore, Ball, 2000; MOller et aL, 2001; Ладыгин, 2002; Govindjee, 2002; Oquist, Huner, 2003 и др.). Большой вклад в эти разработки внесли исследования с использованием генетически модифицированного материала, которые показали место генов, ответственных за работу виолаксантинового цикла (Runge, 1995; Dauborn, Bruggemann, 1998; Hartel, Grimm, 1998; Ладыгин, 1998; Havaux et al., 2000; Niyogi et al., 2001; Govindjee, 2002; Elrad et al., 2002; Walters et al., 2003; Peng, Gilmore, 2003; Jin et al., 2003; Havaux et al., 2004 и др.). Растения с генетическими изменениями рассматриваются как мощный инструмент для изучения регуляции процессов фотосинтеза и сети механизмов, вовлеченных в различные ответные реакции на стресс.

Однако при всех блестящих работах на молекулярно-генетическом уровне остается много нерешенных проблем на уровне организма и тех физиологических механизмов, которые обеспечивают включение защитных реакций и их функционирование в различных условиях среды. Особое внимание в современной литературе уделяется проблеме влияния на растение неблагоприятных климатических условий и факторов антропогенной природы. Насколько универсальны те системы, которые природа вложила в растительные организмы для реакции на природные факторы, и как они будут справляться с антропогенным воздействием? Этот вопрос остается открытым. Спектр стрессовых воздействий очень широк и даже на уровне одного фактора возникает очень много принципиальных отличий в реакции различных видов растений, которые могут

решаться только экспериментальным путем. Кроме того, многие аспекты, связанные со скоростью развития и длительностью действия защитных механизмов и их зависимостью от вида и жизненной формы растения, остаются до конца невыясненными. Все эти вопросы ставят проблему изучения реакции растительного организма на стрессовые воздействия в число современных и актуальных.

Целью данной работы явилось сравнительное изучение фотосинтетического аппарата и механизмов его адаптации у хвойных древесных и травянистых злаковых растений при действии неблагоприятных природных и антропогенных факторов. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- изучить роль пигментов виолаксантинового цикла в защите фотосинтетического аппарата Picea abies L. при действии низких отрицательных температур и высокого уровня освещенности в зимний период;

- исследовать содержание фотосинтетических пигментов и биометрические показатели листа (хвои) у древесных хвойных (Picea abies L. и Pinus sylvestris L.) и травянистого злака Festuca pratensis Huds. в условиях антропогенного загрязнения;

- изучить активность фотосинтетического аппарата Triticum aestivum L. при действии низких и высоких закаливающих температур, а также при отрицательной температуре и

^ различном уровне освещенности;

- исследовать содержание пигментов и активность фотосинтетического аппарата контрольной (сорт Карельская) и мутантных линий Festuca pratensis Huds., обладающей хлорофиллдефектностью в условиях высокой температуры.

Научная новизна.

Впервые показана функциональная активность пигментов виолаксантинового цикла

у древесных хвойных растений в условиях суровых зим северо-таежных зон при быстрых изменениях погоды - оттепель и мороз, сопряженный с высокой освещенностью.

Впервые дана физиологическая характеристика фотосинтетического аппарата (по содержанию пигментов, интенсивности фотосинтеза, параметрам переменной флуоресценции Хлди спектрам излучения ФС I и II при 77 К) температурозависимых хлорофиллдефектных фенотипов контрольной и мутантных линий Festuca pratensis Huds.

Практическая значимость. Полученные экспериментальные данные дополняют и расширяют современные представления об адаптивных возможностях фотосинтетического аппарата древесных хвойных и травянистых злаковых растений при действии неблагоприятных природных и антропогенных факторов и могут быть использованы при чтении базового курса и спецкурсов по физиологии растений в вузах.

Результаты исследования ассимиляционного аппарата двух видов хвойных в условиях слабого и сильного загрязнения могут быть использованы в экологическом мониторинге.

5

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Роль фотосшггстических пигментов в защитных механизмах фотосинтетического аппарата растений

В природных условиях растения подвергаются воздействию многих неблагоприятных факторов, в том числе таким, как избыточное освещение, субоптимальная температура, засуха, ограничение в минеральном питании, насекомые- вредители и болезни. Растения, находящиеся под влиянием одного из этих стрессов, становятся более восприимчивыми к действию другого, дополнительного стресса. Растения, подвергшиеся природному стрессу, более предрасположены к повреждению антропогенными стрессами, например атмосферному загрязнению. Избыточная освещенность имеет большее повреждающее воздействие, когда атмосфера загрязнена поллютантами, такими как N0 и NO2 (Lichtenthaler, 1988). При воздействии низких температур даже умеренная освещенность может привести к фотоингибированию (Somersalo, 1990; Krol et al., 1999; Venema et aL, 1999; Havaux, Kloptech, 2001; Kudo? Sonnoike, 2002; Prafullachnadra et al., 2003; Tsonev et al., 2003).

Свет и температура имеют прямое влияние на процесс фотосинтеза, в то время как другие неблагоприятные факторы могут изменять фотосинтетическую активность непрямым путем, опосредованно. Следовательно, знание физиологических процессов, протекающих в растении в условиях природного стресса, является необходимой предпосылкой для понимания изменений и повреждений, вызываемых антропогенными факторами.

Обнаружена возможность повышения устойчивости растений к действию одного фактора (засоление или температура) с помощью другого (низкая или высокая закаливающая температура). У некоторых видов растений холодовая закалка способствует повышению устойчивости к высоким температурам (Дроздов и др., 1984), а тепловая - к низким (Дроздов и др., 1984; Титов, 1989). Холодовое закаливание уменьшает степень фотоингибирования (Somersalo, Krause, 1989а, 6,1990а, б; Hurry, Huner, 1991, 1992; Oquist et aL, 1993; Hurry et aL, 1995; Ivanov et al., 2003; Prafullachanndra et aL, 2003).

Ассимиляционный аппарат в первую очередь подвергается воздействию стрессовых факторов, и физиологические реакции древесных и травянистых растений могут отличаться. Так, гипотеза о влиянии холодового стресса на фотосинтетический аппарат травянистых, по которой реакционные центры ингибированы, но интактны, не является достаточным объяснением изменений, происходящих в хвойных растениях в условиях зимнего стресса.

Адаптационные возможности ассимиляционного аппарата растений включают как иммобилизацию уже имеющихся приспособительных процессов, так и новые защитные механизмы. Одни из них активируются как ответная реакция на любой стресс, другие (структурные, физиологические и биохимические перестройки) могут быть следствием специфической реакции на тот или иной стресс.

Особый интерес в этой ситуации представляет роль фотосинтетических пигментов — компонентов фотосинтетических структур (фотосистем I и II и светособирающих комплексов). Как известно, функция хлорофилла а заключается в поглощении света с участием дополнительных, светособирающих пигментов (хлорофиллов в, каротиноидов, фикобиллинов) и трансформации энергии света в химическую энергию. Способны ли фотосинтетические пигменты каким-то образом сами регулировать поток световой энергии, поглощаемой и превращаемой в химическую энергию, с целью избежания повреждений, вызываемых избытком света? Многие исследования и выстроенные на их основе гипотезы активации защитных реакций позволяют утвердительно ответить на этот вопрос.

Количество поглощенной энергии может быть снижено посредством уменьшения светособирающих комплексов (снижение количества содержащихся в них пигментов), их Ш) реорганизации.

Избыточная поглощенная энергия может быть рассеяна в виде тепла, как самими реакционными центрами, так и из светособирающих комлексов. Предполагается, что в рассевание энергии из светособирающих комплексов вовлечен виолаксантиновый цикл. Защитная роль виолаксантинового цикла в условиях избыточной освещенности ясна. Активность пигментов виолаксантинового цикла в условиях других стрессов изучается давно и широко, но окончательного решения вопроса о его роли при воздействии того или иного фактора, как и о точном механизме тушения, нет. Поскольку исходно интерес исследователей-физиологов был сосредоточен на виолаксантиновом цикле, то мы сочли ^ важным дать историю его изучения, начало которой было положено в России.

Роль виолаксантинового цикла и других вышеупомянутых механизмов под воздействием различных неблагоприятных факторов подробно рассматривается в секциях 1.3 и 1.4, где освещены результаты и выводы исследований, посвященных этой проблеме.

Виолаксантнновын цикл

В 1957 году Д. И. Сапожников с сотрудниками (Сапожников и др., 1957)

обнаружил виолаксантиновый цикл и высказал предположение об его участии в

а выделении фотосинтетического кислорода. Несколько позднее Н. Д. Кринский (Krinsky,

1966) выдвинул гипотезу о защитной функции пигментов виолаксантинового цикла от

избытка кислорода. Эта гипотеза оказалась более перспективной, и последующие (Lichtenthaler, Schindler, 1992; Schubert et al., 1994), а особенно современные исследователи активно включились в ее разработку (Сгосе et aL, 1999, цит. по: EIrad et aL, 2000).

Ксантофилловый цикл обнаружен в хлоропластах различных фотосинтезирующих организмов: высших растений, мхов, зеленых и бурых водорослей. У диатомовых водорослей, эвгленовых и некоторых других существует аналогичный цикл, но в превращениях участвуют другие эпоксиксантофиллы: диатоксантин и диадиноксантин (Stransky, Hager, 1970). В определенных условиях диатомовые водоросли могут иметь как виолаксантиновый, так и диадиноксантшювый цикл (Lohn, Wilhelm, 1999).

Многие исследования в течение последних десятилетий привели к накоплению знаний о биохимии цикла и его связи с фотосинтетическими реакциями (обзорные работы Sieferman-Harms, 1977; Yamamoto, 1979; Hager, 1980; Demmig-Adams, Adams, 1992; PfimdeL Bilger, 1994; Маслова и др. 1996; Gilmore, 1997; Young et aL, 1997; Niyogi et al., 1998, 1999; Havaux, Niyogi, 1999; Demmig-Adams et al., 1999; Frank, 2000; Gilmore, Ball, 2000; MDller et al., 2001; Ладыгин, 2002; Govindjee, 2002; Oquist, Huner, 2003).

Локализация пигментов виолаксантипового цикла

Организация ксантофиллов, участвующих в цикле, довольно сложна. Около 1% виолаксантина находится в оболочках хлоропластов (Douce, Yoyard, 1979), и этот виолаксантин дезэпоксидируется без стехиометрического увеличения зеаксантина (Sieferman-Harms et aL, 1978). Большинство пигментов виолаксантинового цикла локализуется в тилакоидных оболочках. Дезэпоксидация виолаксантина происходит как в тилакоидах гран, так и в тилакоидах стромы (Sieferman, Yamamoto, 1976). О распределении пигментов цикла среди пигментов белковых комплексов много противоречивых сообщений. Как известно (Yansson, 1994), светособирающий комплекс состоит из нескольких слоев. Внутренний слой состоит из хлорофилла а, р-каротина и связанных с ними белков. Приблизительно 100 молекул Хл а и 10 — 15 (5-каротина в ФСI связаны с двумя полипептидами реакционного центра (Britton, 1993). Антенна ФС II состоит из 4 белков, связанных с 50 молекулами Хл а, 5 р-каротина и, вероятно, несколькими молекулами лютеина (Bassi et aL, 1993). Из 10 белков ССК 4 связано исключительно с ФС II, 4 с ФС I и 2 служат как антенны для обоих фотосистем. По последним исследованиям, распределение 10 антенных белков иное: ССК ФС II — 6 белков, ССК ФС I - 4 белка (Morosinotto et al., 2003; Wehner et aL, 2004). При фракционном разделении пигмент-белковых комплексов значительная часть пигментов цикла находилась в свободном состоянии (Pfundel, Bilger, 1994; Hartel et aL, 1996), но,

8

возможно, они освобождались во время экстракции. Возможность прохождения реакции дезэпоксидирования, связанного с ССК виолаксантина, была впервые предположена Д. Зиферман-Хармс (Siefermann-Harms, 1984). Более поздние исследования подтвердили наличие виолаксантина в ССК и гипотезу его дезэпоксидации (Bassi et aL, 1993; Ruban et aL, 1994; Hartel et aL, 1996). Виолаксантин связан со всеми белками ФС II (Krol et aL, 1995). Дальнейшие исследования показали, что в ответ на высокий свет возрастало количество пигментов цикла, связанных с минорными светоулавливающими белками ФС II (СР29, СР26, СР24) (Montane et aL, 1999; Verhoeven et a., 1999). Дезэпоксидация виолаксантина отмечалась также и в ФС I (Siefermann-Harms, 1984; Thayer, Bjorkman, 1992). По последним данным, виолаксантин, связанный с каждым белком ССК, может превращаться в зеаксантин (Morosinotto et aL, 2003; Wehner et aL, 2004). Однако, (Caftan et aL, 2001; Ruban et aL, 2002) только 2 молекулы зеаксантина на ФС II участвуют в нефотохимическом тушении энергии, то есть функция большей части (~ 20 молекул) пула виолаксантина неясна. М. Хаво и Ф. Тарди (Havaux, Tardy, 1995) предположили, что физическое отсоединение виолаксантина от антенн делает его доступным для дезэпоксидации. В опытах с изолированными ССК in vitro В. И. Грушески с сотрудниками (Gruszecki et aL, 1997) обнаружили светоиндуцированные спектроскопические изменения в ксантофиллах, которые интерпретировали как цистрансизомеризацию каротиноидов. Авторы предположили, что в эти превращения вовлечен виолаксантин и они сопровождаются отсоединением трансвиолаксантина от ССК и миграцией в липиддгую фазу мембраны, где он энзиматически превращается в трансзеаксантин. Эта гипотеза кажется маловероятной для тилакоидных мембран in vivo. Действительно, М. Хаво с сотрудниками (Havaux et aL, 1998) опровергли это предположение, показав что цис-виолаксантин составляет всего 2% от всего пула этого пигмента, следовательно, зеаксантин синтезируется из уже имеющегося трансвиолаксантина. Однако поведение зеаксантина и виолаксантина в пределах ССК различается, что связано с их различной полярностью и конформацией. Уменьшение текучести мембран и содержания зеаксантина (при повышенных температуре и освещенности) сопровождается диффузным перемещением этого пигмента из ССК в липидную фазу (Havaux, Tardy, 1995; Gruszecki et aL, 1997).

Нужно отметить, что виолаксантиновый цикл может функционировать при отсутствии связанных с пигментами белков (PmndeL. Strasser, 1988; Krol et aL, 1995) и функционально активных ССК (Pfimdel, 1993; Yahns, Krause, 1994). Это дало основание предположить, что пигменты виолаксантинового цикла связаны с ELIPs (ранние светоиндуцируемые белки) (Krol et aL, 1995; Montane et aL, 1997; Havaux et aL, 1998; Krol

et al., 1999) и эта связь обнаруживается в условиях высокой освещенности. Хотя позднее теми же авторами (Montane et al., 1999) эта гипотеза была опровергнута, но возникло предположение (Montane, Kloppstech, 2000), что ELIPs-белки появились первыми в цианобактериях, а белки ССК 1 и 2 - позднее, но именно они являются более эффективными как в светособирающей, так и в фотозащитной функции.

Всегда остается какая-то часть виолаксантина: 25% в тилакоидах (Pfundel, Dilley, 1993), от 5 до 10% в листьях (Demmig et al.,1987), которая не дезэпоксидируется и не идентична недоступной для дезэпоксидации фракции виолаксантина — «спрятанная фракция». Было обнаружено, что в условиях высокой освещенности или дополнительного света (Demmig-Adams et aL, 1998) при деградации реакционных центров ФСI и ФСII р-каротин может превращаться в зеаксантин. Этот процесс мог происходить в ССК и в реакционных центрах.

Общее содержание пигментов цикла варьирует в зависимости от вида растений и условий среды. Их количество увеличивается как в высших растениях (Demmig-Adams, Adams, 1992) и клетках культур (Schafer et aL, 1994), так и в зеленых водорослях Chlorella (Schubert et aL, 1994) при сильном увеличении освещенности, а также в некоторых других неблагоприятных условиях (Winter, Demmig, 1987; Маслова и др., 1996; Smirnoff 1996; Ciompi et al., 1997; Montane, 1998; Liu et aL, 2001; Tsonev et al., 2003).

Регуляция виолаксантшювого цикла

Большинство информации о регуляции виолаксантинового цикла получено из опытов с высшими растениями. Внешние факторы, от которых главным образом зависит функционирование цикла, - это свет, температура и состав газовой среды, внутренние -рН, наличие кофакторов и активность энзимов.

Дезэпоксидация. Доступность виолаксантина зависит от восстановленного состояния пула пластохинонов: чем больше он восстановлен, тем больше виолаксантина доступно для дезэпоксидации (Siefermann, Yamamoto, 1975a). Однако механизм этого контроля точно не известен, хотя увеличение восстановленности пластохинона связано с низкими рН, а доступность виолаксантина возрастает с повышением кислотности (Pfimdel, Dilley, 1993; Pfimdel et aL, 1994). Есть данные, что УФ-радиация уменьшает доступность виолаксантина (Pfimdel et aL, 1992; Sharma et aL, 1998).

Прямая реакция (дезэпоксидация) регулируется дезэпоксидазой (молекулярный вес 43 кДа), которая локализована в тилакоидном люмене. Так как этот фермент обратимо ингибировался дитиотрейтолом (сульфагидрильный реагент), было предположено, что этот энзим содержит сульфагидрильные мостики. Он локализуется на наружной стороне мембраны. Дезэпоксидация происходит при низких рН (Hager, 1966), с оптимумом для

10

изолированных хлоропластов рН 4,8 и для изолированного энзима рН 5,2 в присутствии кофактора — аскорбата. Его концентрация в хлоропластах колеблется от 10 до 25 тМ (Schoner, Krause, 1990), что вполне достаточно для прохождения реакции, и он не является ограничивающим фактором.

Показано, что прохождение реакции дезэпоксидации сильно зависит от интенсивности света. Было установлено (Попова и др., 1971), что существует

^> определенный порог в интенсивности света, ниже которого зеаксантин не выявляется, и,

как считают авторы, в этих условиях скорости прямой и обратной реакции скоординированы. Выше пороговой интенсивности скорость прямой реакции превышает скорость обратной, и это фиксируется по накоплению зеаксантина. Положение порога прежде всего зависит от светолюбия растения. Применение ингибирования обратной реакции с использованием СА показало (Сапожников и др., 1972), что реакции идут и при подпороговых величинах. Снижение температуры сдвигает уровень порога в сторону низких интенсивностей света. Световые кривые реакции дезэпоксидации подобны типичным световым кривым фотосинтеза (Маслова и др., 1996). Характер реакции зивисит не только от интенсивности света, но и от продолжительности его действия (Попова, Рыжова, 1972). Эта реакция осуществляется в довольно широком интервале kgj температур (Hager, 1980).

Состав газовой среды имеет большое влияние на прохождение дезэпоксидации. Еще в 1959 году Д. И. Сапожников с сотрудниками (Сапожников и др., 1959) впервые высказал предположение о различных механизмах прохождения этой реакции в присутствии и в отсутствии кислорода в среде. Дезэпоксидация виолаксантина становилась нечувствительной к гидроксиламину и диурону при обработке растений в условиях анаэробиоза. Эти факты позволили предположить, что в присутствии кислорода дезэпоксидация происходит с участием ФС II и осуществляется путем фотоокисления эпоксидных групп виолаксантина, что приводит к выделению фотосинтетического рШ кислорода. С другой стороны, вероятно, в анаэробных условиях дезэпоксидация проходит

с участием ФС I, идет через восстановление эпоксидных групп и ведет к образованию воды. Изучение дезэпоксидации виолаксантина на стромальной стороне тилакоидной мембраны показало, что виолаксантин превращается в зеаксантин в липидном матриксе, а не на белках (Macko, Wehner, 2002, цит. по: Wehner et aL, 2004). Таким образом, была предложена следующая схема: 1 — высвобождение виолаксантина (В) в липщцгую фазу; 2 — диффузия В к дезэпоксидазе; 3 — дезэпоксидация В в липидном матриксе; 4 —

i^ связывание зеаксантина с белками. Стадии 1 и 4, очевидно, контролируются рН.

И

Эпоксидация. Эпоксидаза — флавинаденинмонооксигеназа (кислородзависимая), которая использует восстановленный ферредоксин для эпоксидации зеаксантина и антераксантина (Bouvier et aL, 1996). Фермент локализуется на внутренней стороне мембраны. Это заключение базируется на факте, что оптимум эпоксидазы (рН 8) близок к рН стромы. Эпоксигруппы виолаксантина и антераксантина происходят из молекулярного кислорода (Yamamoto, Takeguchi, 1972). Эпоксидация ингибируется низкими концентрациями О2 (Hager, 1980). Слабый свет стимулирует эту реакцию. Так как эпоксидация и восстановление НАДФ тесно связаны, то была предположена необходимость восстановления кофактора для прохождения реакции (Siefermann-Harms, 1977). В изолированных тилакоидах эпоксидация была вполовину от максимальной при 0,04 шМ НАДФН и достигала насыщения при 0,4 mM (Siefermann, Yamamoto, 19756). В строме хлоропластов НАДФН имеет концентрацию 0,3 mM для световых и 0,1 mM для теневых условий (Heineke et aL, 1991). Следовательно, НАДФН не является ограничивающим фактором функционирования цикла in vivo.

Функции виолаксантинового цикла

Связь ксантофиллового цикла с процессом фотосинтеза считается установленной, но роль его в этом процессе еще до конца не ясна.

Гипотеза Сапожникова. Идея об участии виолаксантинового цикла в выделении кислорода в процессе фотосинтеза возникла у М. Кальвина (1951) ц Д. И. Сапожникова (1957, 1967) при рассмотрении прежде всего химического строения ксантофиллов этого цикла. Было установлено, что место действия цикла находится вблизи кислородвыделяющих систем. Так, было обнаружено (Сапожников, Сахарова, 1964а), что удаление из исследуемого растения марганца сильпо нарушало работу виолаксантинового цикла. Было показано (Маслова и др., 1996), что реакции превращения ксантофиллов могут быть заторможены теми же ингибиторами, которые подавляют выделение кислорода при фотосинтезе (гидроксиламин и диурон). Более прямые доказательства связи виолаксантинового цикла с выделением кислорода были получены в опытах с использованием изотопных меток. Д. И. Сапожниковым с сотрудниками была выполнена серия работ с использованием обогащенной тяжелым кислородом воды (Сапожников и др., 19646). При изучении кинетики включения тяжелого кислорода в виолаксантин из Н218О была показана возможность такого включения. Кроме того, обнаружено прямое включение меченого кислорода из Нг18О. Однако эти последние данные вызвали возражение. Факт включения тяжелого кислорода из воды считали вторичным, т.е. в виолаксантин мог включаться меченый молекулярный кислород, выделяющийся на свету из воды при фотосинтезе. Вторым серьезным возражением было несоответствие величины

12

метки 180 в выделенном при фотосинтезе Огив виолаксаптине. Однако расчет метки велся на весь имеющийся в клетке виолаксантин, без учета его гетерогенности. По мнению Т. Г. Масловой с сотрудниками (1996), для дальнейшего развития гипотезы об участии виолаксантина в выделении кислорода при фотосинтезе важно сопоставить скорости этих двух процессов.

Гипотеза Крински. Н. Д. Кринский (Krinsky, 1966) показал, что добавление малата или других восстановителей к лиофилизированным клеткам Euglena в темноте увеличивало процент диатоксантина. Он предположил, что образование эпоксид-составляющих цикла защищает клетки от фотоокислительной деструкции. В триплетном состоянии активированный светом хлорофилл, обычно инактивируемый через процесс фотосинтеза, реагирует с молекулярным кислородом, образуя синглетный кислород. Этот хОг может индуцировать летальное окисление клетки, и его включение как кислорода эпоксигрупп предотвращает повреждение клетки. Эта гипотеза также вызвала ряд возражений. Хотя более поздние исследования (Lichtenthaler, Schindler, 1992; Schubert et al., 1994) предположили утилизацию синглетного кислорода в реакции эпоксидации. Так, было показано, что синглетный кислород может быть нейтрализован лютеином и неоксантином в ССК ФС II или зеаксантином и а-токоферолом в тилакоидных мембранах (Сгосе et al., 1999 цит. по: Elrad et aL, 2002). Другое подтверждение этой гипотезы пришло из опытов с тройным мутантом Chlamidomonas (Baroli et aL, 2002), который накапливал зеаксантин и был устойчив к высоким уровням экзогенного реактивного кислорода.

Гипотеза М. Квияонес. Е. Зайгер (Quinones, Zeiger, 1994). Эти авторы предположили, что зеаксантин может быть фоторецептором синего света, поскольку была получена линейная зависимость между индуцированным синим светом (фототропным ответом) и содержанием зеаксантина.

Гипотеза Б. Деммиг-Адамс. В настоящее время большинство работ касается защитной роли ксантофиллового цикла против фотодеструкции фотосинтетического аппарата. Защита осуществляется посредством нерадиационного рассеивания энергии дезэпоксипигментом зеаксантином (Demmig, Bjorkmann, 1987; Demmig-Adams, 1990a), но в реакции могут участвовать также шггераксантин и лютеин (Gilmore, Yamamoto, 1993; Goss et aL, 1998; Niyogi et aL, 2001). Корреляция между этим тушением и образованием зеаксантина в интактных листьях была впервые обнаружена Б. Деммиг-Адамс (Demmig-Adams et aL, 1987). Зависимость между содержанием зеаксантина и тушением - линейная. Это показано большим числом исследований в различных условиях среды (Demmig-Adams, 1990; Adams, Demmig-Adams, 1992, 1994; Frank et aL, 1992; Pfundel, Bilger, 1994; Jahns, Miehe, 1996; Ciompi et aL, 1997; Montane et aL, 1998; Demmig-Adams et aL, 1998;

13

Buffoni et aL, 1998; Logan et aL, 1998; Masojidek et aL, 1999; Havaux et aL, 2000; Govindjee, 2002; Jin et aL, 2003; Havaux et aL, 2004). Значительная часть нефотохимического тушения (называемая qE) зависит от транстилакоидного АрН.

Эта ситуация возникает в условиях, когда поглощение световой энергии хлорофиллом превышает ее использование в фотосинтезе. "Избыточное" освещение может быть как при высокой, так и при низкой освещенности в условиях стрессов, снижающих активность фотосинтеза (недостаток кислорода, неблагоприятная температура, загрязнение) (Winter, Demmig, 1987; Маслова и др., 1996; Smirnoff 1996; Ciompi et aL, 1997; Montane, 1998; Liu et aL, 2001; Tsonev et aL, 2003).

Большая часть информации о роли ксантофиллового цикла в фотозащите получена методом флуоресцентного анализа. Флуоресценция хлорофилла при комнатной температуре соответствует части световой энергии, улавливаемой фотосинтетическими пигментами и, в основном, испускается из ФС II (Krause, Weis, 1991). Флуоресценция низка, когда абсорбируемая энергия эффективно используется в фотохимии (фотохимическое тушение) или в других процессах, суммарно называемых нефотохимическое тушение. Экспериментально фотохимическое тушение может быть снижено до нуля посредством насыщающих световых импульсов, и в этом случае может быть оценено нефотохимическое тушение (Schreiber et aL, 1986; Mflller et aL, 2001, раздел «Методика»).

Возможные механизмы зеаксаптипзависимого тушения. Предполагается (Demmig-Adams, Adams, 1998), что местом тушения являются пигмент-белковые комплексы ФС II. Это гипотеза основана на следующих фактах: большая часть виолаксантина находится в ССК ФС II и превращается в зеаксантин; ДТТ (дитиотрейтол - ингибитор дезэпоксидазы) — зависимое qE тушение связано с инициальной флуоресценцией Fo, которая является индикатором тушения в антенных комплексах (Walters, Horton, 1993); отмечаются одинаковые спектральные изменения в испускаемой флуоресценции и спектре абсорбции (Ruban et aL, 1991); растения с уменьшенным или нефункциональным ССК имеют значительное снижение нефотохимического тушения (Jahns, Krause, 1994). Однако существуют работы, ставящие под сомнение эту гипотезу. Так, в опытах с ДТТ В. Сааков (1998) показал, что кинетика изменений Fo и накопления зеаксантина была разной (изменение Fo развивалось быстрее, чем шло образование зеаксантина). Авторами гипотезы были получены противоречивые эффекты: при совместном действии ДТТ и хлорамфеникола обнаружено сильное ингибирование фотосинтеза; процесс рассеивания энергии усиливался при высокой освещенности и не прекращался при возвращении в нормальные световые условия. На основании этих фактов был предложен

14

дополнительный механизм, названный ксантофиллнезависимым тушением фотоингибированных реакционных центров ФС II, которые могут работать как гасители энергии (Somersalo, Krause, 1990; Krause, Weis, 1991; Maxwell et aL, 1995; Oquist et aL, 2003; Buchov et aL, 2003). Есть предположение, что этот механизм включается, когда зеаксантинзависимое рассеивание энергии ингибируется или не справляется. Вопрос существования и связи этих двух механизмов остается открытым.

Прямое тушение. Существование этого механизма предположила Б. Деммиг-Адаме (Demmig-Adams, 1990), а подтверждение прямого тушения флуоресценции хлорофилла зеаксантином получено во многих работах (Adams, Demmig-Adams, 1992, 1994; Jahns, Miehe, 1996; Ciompi, 1997; Goss et aL, 1998; Demmig-Adams et aL, 1998; Logan et aL, 1998; Buffoni et aL, 1998; Masojidek et aL, 1999; Frank et aL, 1999, 2000; Ma et aL, 2003). Модель, основанная на свойствах каротиноидов, была представлена Т. Г. Овенс с сотрудниками (Owens et aL, 1992). Перенос электронов между хлорофиллом и каротиноидами, вероятно, осуществляется через механизм электронного обмена Декстера, который требует тесной близости этих пигментов с перекрытием их спектров. Энергетически это может быть свойственно каротиноидам в первом синглетном состоянии Si (2 Ag), которое соответствует более низкому энергетическому уровню. Однако напрямую переход каротиноидов в Si состояние невозможен, и этот процесс осуществляется путем внутренних превращений из S2 состояния. Было обнаружено, что энергия Si состояния уменьшается с увеличением длины полиеновой цепи (Owens et aL, 1992) и энергетически каротиноиды с 10 конъюгированными двойными связями в синглетном состоянии более близки к энергии хлорофилла а. С помощью абсорбционной спектроскопии (Frank et aL, 1994) было обнаружено, что Si состояние виолаксантина выше, а зеаксантина ниже энергетического уровня хлорофилла. При дезэпоксидации виолаксантин с 9 конъюгированными связями превращается в зеаксантин с 11 связями и эти, более длинноцепочные, каротиноиды в Si состоянии могут участвовать в переносе электронов. Дальнейшее подтверждение этой гипотезы было получено И. 3. Ма с сотрудниками (Ma et aL, 2003) в опытах с трансгенным Arabidopsis (мутанты с различной композицией каротиноидов). При использовании фемтосекундного абсорбционного анализа было показано прямое включение зеаксантина в процесс тушения излишней энергии. Зеаксантинзависимое тушение требует низких значений трансмембранного АрН, что увеличивает спектральное перекрытие синглетного хлорофилла и зеаксантина, что, в свою очередь, увеличивает тушение (Owens et aL, 1992). Эффект подкисления может индуцировать конформационные изменения, способствующие более близкому положению ксантофилла и хлорофилла (Demmig-Adams, 1990). Особого внимания заслуживает р-

15

каротин, который спектрально идентичен зеаксантину, исключая гидроксигруппы, что предполагает возможность его участия в тушении избыточной энергии хлорофилла (PfundeL. Bilger, 1994).

Непрямое тушение. В работах С. Шиндлер и X. К. Лихтенталер (Schindler, Lichtenthaler, 1994) было установлено, что кинетика накопления зеаксантина и уменьшение максимальной флуоресценции (Fm) различаются. Образование зеаксантина

,ik завершалось до снижения вариабельной флуоресценции (Fv). Затем это снижение

продолжалось при низкой освещенности, когда зеаксантин уже превращался в виолаксантин. Был сделан вывод о том, что зеаксантин не играет роли в прямом рассеивании энергии, а механизм тушения включает агрегирование ССК ФС II при участии зеаксантина (Walters, Horton, 1991, 1993; Horton, Ruban, 1992; Richter et aL, 1994; Andersson, 2001; Nyogi,1997 - 2003; Govindjee, 2002; Elrad et aL, 2002 ).

Виолаксантин более полярен, чем зеаксантин, вследствие присутствия эпокси-групп в 5-й и 6-й позициях. Введение полярных групп изменяет стереохимию каротиноидов. Для Р-каротинаугол между циклической двойной связью и двойной связью полиеновой цепи был 40%, для кантаксантина этот угол увеличивался до 50%. Подобные различия предполагаются и для зеаксантина с виолаксантином (Siefermann, Yamamoto,

Ш) 1975), что означает изменение свойств мембран при участии этих пигментов.

Обнаружено, что текучесть мембран уменьшается с увеличением содержания зеаксантина. Когда образование зеаксантина было ингибировано ДТТ, эти изменения закономерно уменьшались, что было доказано при оценке скорости окисления пластохинонов флуоресцентным анализом (Gruszecki, Stralka, 1991; Havaux, Gruszeski, 1993). Полагают, что зеаксантин может стабилизировать комплексы ФС II ригидификацией мембраны. Но значение текучести мембраны для тушения энергии не ясно. П. Хортон с сотрудниками предположил, что зеаксантин, усиливая агрегацию CCKII, способствует нерадиациошюму рассеиванию энергии (Horton et aL, 1991; Horton, Ruban, 1994). Дальнейшими ^ исследованиями было обнаружено (Horton, Ruban, 1999), что ксантофилловый цикл

является модулятором qE (энергозависимой части qN) и гашение связано с олигомеризацией CCKII и агрегированием белков (Ruban et aL, 1997). Роль агрегации ССК в тушении была подтверждена С. В. Мюллино (Mullineaux et aL, 1993). В ходе агрегации ССК время разрешения спектроскопии уменьшалось с 43 наносекунд до 110 пикосекунд и рассеивание возбужденной энергии значительно увеличивалось. Отношение виолаксантина к зеаксантину роли не играло. В опытах с антимицином было показано, что

,l\ он препятствует зеаксантинзависимому тушению энергии и также ингибирует агрегацию

~ ССК (Gilmore, Yamamoto, 1991). В интактных листьях при тушении было обнаружено

16

увеличение абсорбции при 520 - 540 нм (Ruban et al., 1993; Bilger, Bjorkman, 1994). При агрегации изолированных ССК были обнаружены те же спектральные изменения (Ruban et al., 1992) in vivo, что дает основание предполагать их регуляцию совместным действием зеаксантина и АрН. Молекулярный механизм этих абсорбционных изменений был описан А. В. Рубан (Ruban et aL, 1993). С увеличением полярности растворителя наблюдался сдвиг спектральных характеристик ксантофиллов в синюю область видимого спектра. При агрегации также появлялись группы со сдвигом в краыгую область спектра, область мономерных ксантофиллов. Этой группе ксантофиллов приписывается образование агрегатов "голова — хвост". Однако, in vivo этих корреляций не обнаружено (Bilger et aL, 1989; Bilger, Bjorkman, 1994). Таким образом, механизм непрямого тушения тоже остается до конца невыясненным.

В то время как участие ксантофиллового цикла в термической диссипации из антенн ФС II почти не вызывает сомнений, дискуссии ведутся относительно белков ССК ФС II (большая антенна или малые белки СР26 и СР29), связанных с зеаксантином. Важную роль в этих исследованиях играют мутанты, дефектные по тому или иному белку. Было показано, что связывание зеаксантина с СР26 и СР29 приводит к уменьшению флуоресценции хлорофилла in vitro (Crimi et aL, 2001). С другой стороны, Д. Андерсон (Andersson et aL, 2001) на мутанте Arabidopsis без СР26 и СР29 показал, что нефотохимическое тушение не изменилось. В то же время было обнаружено (Chow et aL, 2000), что существует корреляция между большой антенной и нефотохимическим тушением. Это противоречит результатам другой группы исследователей (Gilmore, 1996), которые на мутанте ячменя с меньшим количеством белков ССК показали, что нефотохимическое тушение не изменилось. Д. Эльрад с сотрудниками (Elrad et aL, 2002) изолировали целый ряд мутантов Chlamidomonas и Arabidopsis. В одном из мутантов (npq5) отсутствовал Lhcbml (белок большой антенны), что привело к снижению нефотохимического тушения и содержания пигментов.

Эти противоречивые и разрозненные данные были объединены в схему термического рассеивания энергии (Govindjee, 2002; Elrad et aL, 2002), которая требует дальнейших исследований (рис. 1).

Список литературы
Цена, в рублях:

(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)
1425
Скачать бесплатно 25150.doc 





Найти готовую работу


ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:


Связаться

Доставка любой диссертации из России и Украины



Ссылки:

Выполнение и продажа диссертаций, бесплатный каталог статей и авторефератов

Счетчики:


© 2006-2016. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.