У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ
Заказать диплом, курсовую, диссертацию


Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Понравилось
Не понравилось





Книга жалоб
и предложений

 





Название Основные механизмы конституционального иммунитета насекомын
Количество страниц 155
ВУЗ мгиу
Год сдачи 2010
Бесплатно Скачать 25185.doc 
Содержание Содержание
Оглавление Введение..._..._____...-...-...-...-------. б

Глава 1. Материалы и методы,...14

1.1. Насекомые___...-..._...-...—..._____...14

1.2. Энтомопатогенные микроорганизмы и методы заражения насекомых...15

1.3. Приборы и реактивы..__...__._..._...17

1.4. Исследование зараженных тканей насекомых...18

1.5. Отбор гемолимфы и приготовление гомогенатов внутренних органов...19

1.6. Определение активности и спектра неспецифических эстераз, активности глутатион-З-трансферазы...20

1.7. Определение продукции активированных кислородных метаболитов...22

1.8. Определение активности супероксидцисмутазы и концентрации тиолсодержаших соединений...24

1.9. Определение паттерн-распознаюших белков...24

1.9.1. Определение агглютинрующей активности гемолимфы капустной совки...24

1.9.2. Определение паттерн-распознаюших белков в гемолимфе большой вощиной моли...26

1.10. Определение белка...26

1.11. Статистическая обработка

экспериментальных данных...27

Глава 2. Генерация активированных кислородных

метаболитов у насекомых и ее изменение

при различных патогенезах...28

2.1. Источники и основные свойства АКМ...29

2.1.1. Строение и свойства АКМ...29

2.1.3. Источники АКМ в организме...34

2.1 А. Фенолоксидазоактивирующая система...37

2.2. Методические подходы при изучении активированных кислородсодержащих метаболитов...48

2.2.1. Люминол-зависимая хемилюминесценция...49

2.2.2. Метод восстановления нитросинего

тетразолия (НСТ)...52

2.2.2.1. Влияние активаторов фагоцитоза на восстановление нитро-синего тетразолиевого в гемоцитах насекомых...58

2.2.2.2. Влияние ингибиторов на восстановление НСТ

в гемоцитах насекомых...вЭ

2.2.3. Метод спиновых ловушек..._...78

2.3. Генерация активированных кислородных метаболитов при различных патогенезах...87

2.3.1. Образование АКМ при микроспоридиозе насекомых..88

2.3.1.1. Влияние микроспоридиоза на фенолоксидазную активность гемолимфы...92

2.3.1.2. Влияние микроспоридиоза на восстановление нитросинего тетразолия в гемоцитах личинок

G. mellonella...97

2.3.1.3. Окисление СР-Н гемолимфой личинок G. mellonella при микроспоридиозе...99

2.3.2. Изменение продукции АКМ насекомых

при бактериозах...104

2.3.2.1. Изменение продукции АКМ при инъекции бактерий в

3

гемоцель насекомых...105

2.3.2.2. Изменение продукции АКМ у личинок G. mellonella в течение бактериоза...115

2.3.3. Изменение продукции АКМ насекомых при микозах..-. .120

2.3.4. Заключение...125

Глава 3. Детоксицируюшие ферменты насекомых..._...128

3.1.1. Микросомальные монооксигеназы.---------...130

3.1.2. Неспецифические эстеразы насекомых...131

3.1.3. Глутатион-Э-трансферазы,...134

3.1.4. Факторы, влияющие на активность детоксицирующих ферментов...__._..._... 136

3.2. Изменение активности детоксицирующих ферментов насекомых при патогенезе...138

3.2.1. Влияние микроспоридиоза на спектр

и активность неспецифических эстераз...139

3.2.1.1. Изменение активности и спектра

эстераз гемолимфы G. mellonella...139

3.2.1.2. Изменение активности и

спектра эстераз жирового тела G. mellonella...143

3.2.1.3. Изменение активности и спектра эстераз среднего кишечника личинок G. mellonella...144

3.2.1.4. Тилирование неспецифических эстераз...152

3.2.1.5. Влияние микроспоридиоза на активность

глутатион-Б-трансфераз...155

3.3. Влияние микозов на спектр и

активность неспецифических зстераз...161

3.3.1. Типирование неспецифических эстераз при микозах.178

3.3.2. Влияние микозов на спектр и активность

4

глутатион-S- трансфераз и микросомальных

монооксигеназ...183

3.3.4. Изменение чувствительности G.mellonella к

инсектицидам при микозах...186

3.5. Влияние кристаллообразуюших бактерий на спектр и активность неспецифических эстераз личинок большой

вощиной моли...189

3.5. Заключение...195

Глава 4. Антиоксидантная система насекомых...197

4.1. Ферментативные антиоксиданты.___...__...197

4.2. Неферментативные антиоксиданты...204

4.3. Активность антиоксидантов в тканях личинок

G. mellonella при различных заболеваниях...207

4.3.1. Влияние микроспоридиоза на активность

супероксиддисмутазы..._...207

4.3.2. Изменение концентрации тиолсодержаших соединений в гемолимфе G. mellonella при микроспоридиозе...214

4.3.3. Уровень и активность антиоксидантов в кишечнике личинок G. mellonella при перроральном инфицировании бактериями Bacillus thuringiensis ssp.galleriae...218

4.4. Заключение...-...-...225

Глава 5.Паттерн-распознающие белки насекомых...226

5.1. Агглютинины капустной совки...232

5.2. Паттерн-распознающие белки большой вощиной огневки.__... .240

Заключение...246

Выводы...255

Список литературы__________...255

5

Введение



Введение

В окружающей среде существует большое количество различных микроорганизмов, а также многоклеточных организмов, способных поражать насекомых. Вполне закономерно, что у данной группы животных формируются эффективные системы, препятствующие проникновению в организм различных чужеродных агентов, способных их элиминировать и нейтрализовать токсичные продукты жизнедеятельности паразитов. В первую очередь сюда следует отнести различные покровы насекомых - кутикулу и перитрофический матрикс. Однако многие патогены способны проникать через эти покровы. Тогда на первый план при формировании защиты организма насекомых выступают такие системы, как профенолоксидазная, клеточная, агглютинирующая, коагулирующая и антибактериальная системы [Nappi, Vass, 1993; Hultmark, 1996;1998; Nappi, Ottaviani, 2000; Lavine, Strand, 2002; Yu et al., 2002;Parrinello et al., 2003]. Как правило, активизация и взаимодействие данных систем с проникшим в гемоцель агентом происходит одновременно и при взаимодействии различных компонентов этих систем. В ряде случаев активизация одного из звеньев системы может привести к активизации ряда компонентов из других систем. Кроме того, существенное значение в процессах иммунного ответа насекомых приобретают детоксицирующие и антиоксидантные системы [Ahmad, 1992; Seslija et al., 1999; Rogina, Helfand, 2000]. Последние нейтрализуют и элиминируют как вторичные продукты метаболизма патогенных микроорганизмов, так и непосредственно продукты жизнедеятельности

собственных клеток, которые могут образовываться при возникновении и течении ряда заболеваний (так называемые эндобиотики).

При активации профенолоксидазного каскада образуется большое количество кислородсодержащих радикалов и, как следствие - активированных кислородных метаболитов (АКМ), которые активно могут вовлекаться в механизмы элиминации чужеродных агентов. Предполагается, что основным кислородсодержащим радикалом в этих каскадных реакциях является семихинон [Nappi, Vass, 2002; Sugumaran, 2002], но к настоящему времени прямой регистрации данного соединения не было проведено в гемолимфе насекомых. Все выводы были сделаны по косвенным данным. Практически отсутствуют данные по изменению генерации АКМ при различных патогенезах, в течение которых может существенно изменяться баланс АКМ и антиоксидантной системы. Кроме того, существуют спорадические работы по изменению детоксицирующей системы насекомых при различных заболеваниях. Отсутствуют данные об изменениях уровня генерации АКМ, антиоксидантной и детоксицирующей системы в различных органах насекомых. Не исколючено, что уровень и активность компонентов вышеперечисленных систем будет существенно меняться в течение различных инфекций в организме насекомых. Нет данных по влиянию паттерн-распознаюших белков на активность гемоцитов и на генерацию АКМ в этих клетках. В результате практически отсутствует общие представления о взаимодействии этих систем при проникновении различных паразитов в организм насекомого.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось комплексное изучение основных механизмов конституционального иммунитета и их изменений в организме насекомых под влиянием различных заболеваний.

Для успешного выполнения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить генерацию активированных кислородных метаболитов у насекомых и ее изменение при различных патогенезах.

2. Исследовать влияние патогенов на изменение спектра и активности детоксицирующих ферментов.

3. Изучить влияние патогенов на активность ферментативных и неферментативных антиоксидантов.

4. Исследовать паттерн-распознающие белки насекомых и их участие в активации систем, продуцирующих активированные кислородные метаболиты.

Научная новизна. В работе впервые приводятся данные по свободно-радикальному окислению в организме насекомых. С использованием ряда современных модифицированных методик обнаружен полухиноновый радикал в каскаде реакций меланогенеза. Впервые при исследовании генерации активированных кислородных метаболитов (АКМ) в гемоцитах выявлено, что активация продукции АКМ происходит в результате адгезии и фагоцитоза. Продукция АКМ в гемоцитах осуществляется в результате деятельности ферментов дыхательной цепи и каскада реакций меланогенеза. Показано, что при бактериозе, микозе и микроспоридиозе происходит супрессия продукции АКМ в гемолимфе.

Впервые изучено изменение спектра и активности неспецифических эстераз и глутатион-Б-трансфераз, супероксидцисмутазы у насекомых при бактериозах, микозах и микроспоридиозах. Впервые показана экспрессия дополнительных изоформ эстераз и повышение активности эстераз в гемолимфе насекомых при ранении, микозах и микроспоридиозах. При экспрессии дополнительных изоформ эстераз резко повышается устойчивость насекомых к ряду инсектицидов.

Впервые выявлены изменения в активности антиоксидантнов в различных органах насекомых при патогенезах. Показано, что паттерн-распознаюшие белки (агглютинины и адгезивные белки) способны усиливать ряд клеточных реакций с участием гемоцитов, которые являются ключевыми в клеточном иммунитете насекомых. Проводится анализ взаимодействия систем генерации АКМ, агглютинирующей, антиоксидантной и детоксицирующей при формировании иммунитета насекомых.

Практическая ценность. Выяснение взаимоотношений компонетов различных систем конститутционального иммунитета позволяет прогнозировать течение ряда широкораспространенных инфекций насекомых. Разработаны подходы для оценки состояния клеточного иммунитета как интегральной характеристики состояния организма насекомых. Данная оценка может позволить проводить прогноз динамики численности насекомых в природных популяциях. Выявлены факторы, обусловливающие синергизм биопрепаратов на основе энтомопатогенных грибов и химических инсектицидов,

предложены оригинальные методы к созданию новых препаративных форм биопрепаратов.

Материалы диссертации используются при чтении курсов лекций по физиологии насекомых, патологии насекомых, биологическим средствам зашиты растений в Новосибирском и С-Петербургском Агроуниверситетах, Томском государственном университете. Материалы были также использованы при подготовке коллективной монографии «Патогенны насекомых: структурные и функциональные аспекты», изданной в 2001 г. в рамках федеральной президентской программы «Интеграция».

Основные положения, выносимые на защиту.

I. Основными активированными кислородными метаболитами гемолимфы, участвующими в формировании резистентности насекомых, являются семихиноны, производные тирозина, а в гемоцитах - семихиноны и продукты дыхательной цепи. Характер изменений в продукции активированных кислородных метаболитов при патогенезах меняется в зависимости от вида патогена и его стадии развития.

I1. Существенную роль при элиминации паразита и детоксикации его метаболитов играют неспецифические эстеразы, экспрессия которых происходит на первых этапах инфицирования насекомого, что приводит к повышению резистентности насекомых к ксенобиотикам, в частности - к инсектицидам.

III.В механизмах детоксикации и элиминации метаболитов патогенов существенную роль играют ферментные и неферментные антиоксиданты, изменение

10

уровня и активности которых зависит от типа патогенеза.

IV. В активации клеточного иммунитета большое значение имеют паттерн-распознающие белки, способные вызывать клампообразование, распластывание и дегрануляцию гемоцитов. Данные белки способны взаимодействовать с высокореакционными активированными метаболитами за счет тиоловых комопонентов, входящих в их состав. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции "Беспозвоночные животные Южного Зауралья и сопредельных территории" (Курган, март 1998), на конференции "Паразиты в природных комплексах и рисковые ситуации" (Новосибирск, июнь 1998), на VI Европейском энтомологическом конгрессе (Чехия, август 1998), конференции «Взаимоотношения паразита и хозяина» (Москва, декабрь,1998), на ежегодном координационном совещании (Annual Coordination Workshop US AID CDR/CAR and INTAS European Union, Ben Gurion, Israel, april-may, 1999), на Международном симпозиуме "Сохранение и защита горных лесов" (Ош, октябрь 1999), на шестом Международном симпозиуме «Chemical and biological mechanisms in susceptibility to and prevention of environmental diseases» (Paris, Universite Rene Descartes, July, 2000), на шестом Международном симпозиуме «Spip Traps, Nitroxides and Nitric Oxide: Spectroscopy, Chemistry and free Radical Biology» (Marseille, France, August, 2000), на XII съезде Русского Энтомологического

11

общества (Санкт-Петербург, август 2002), на VII Европейском энтомологическом конгрессе (Греция, октябрь 2002), на научно-практической конференции, посвященной 100-летию профессора Е.В.Талалаева, (Иркутск, 2002), на первой Международной школе-семинаре «Кровососущие насекомые - переносчики трансмиссивных заболеваний» (Москва, октябрь, 2002), на междунароной конференции «Физика и элементарные химические процессы» (VI Voevodsky Conference, «Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes», Новосибирск, июль, 2002), на отчетных сессиях ИСиЭЖ СО РАН (1994, 1996, 1998, 2000, 2002), на заседаниях микробиологического общества (2000, 2002).

Публикации. Основные материалы изложены в 24 научных работах, опубликованных в центральных российских и зарубежных изданиях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 318 страницах машинописного текста, включая 4 таблицы и 82 рисунка. Работа состоит из введения, описания материалов и методов, четырех глав, заключения, выводов и списка литературы.

Благодарности. Автор глубоко признателен своим учителям Н.В.Васильеву, Шарапову В.М., Лужковой А.Г., Панковой Т.Ф., Кривец С.А. за всестороннюю поддержку, неоценимые советы, терпимость и доброжелательность. Признателен коллективу лаборатории патологии насекомых ИСиЭЖ СО РАН за поддержку и помощь в проведении экспериментальных работ, Исси И.В. и Соколовой Ю.Я. за конструктивную критику и

12

помощь в исследованиях микроспоридий, Слепневой И. А. и Комарову Д. А. за бесценные советы, обсуждение и конструктивную критику, за постановку ряда экспериментальных работ.

13

1. Материалы и методы

1.1. Насекомые

Объектами исследований служили личинки последних возрастов насекомых представителей отрядов: Lepidoptera: большой вощиной огневки (G. mellonella), капустной совки (Mamestra brassicae), сибирского шелкопряда (Dendrolimus sibiricus), непарного шелкопряда (Lymantria dispar), боярышницы (Aporia crataegi), крапивницы (Aglais urticae); Coleoptera: колорадский жук (Leptinotarsa decmlineata); Odonata: большое коромысло (Aeschna grandis, A. juncia, A. viridis); Orthoptera: сверчков (Gryllus bimaculatus). Лабораторную культуру G. mellonella содержали при температуре 28°C на питательной среде и при полной темноте (Тама-рина, 1987). Лабораторную культуру сверчков G. bimaculatus содержали согласно рекомендациям (Князев, 1985). Личинок М. brassicae, A. crataegi, D. sibiricus, A. urticae, стрекоз рода Aeschna, колорадского жука L. decmlineata отбирали из природных популяций в период с мая по сентябрь в различных районах Новосибирской области. Перед началом исследований личинок содержали в не менее чем двух дней в лабораторных условиях при комнатной температуре 22 ± 2°С и 14-ти часовом дне. Гусениц L. dispar вьюодили из яйцекладок, которые были ранее собраны в очаге массового размножения в Новосибирской области Татарского района. В лабораторных условиях гусениц содержали на естественном корме (листья березы) при температуре 20°С и относительной влажности воздуха 80 %. Гусениц боярышницы кормили листьями

14

черемухи, личинок колорадского жука - листьями картофеля, личинок стрекоз содержали в аквариумах (40x25x30 см) и кормили трубочником или личинками комаров рода Aedes.

1.2. Энтомопатогенные микроорганизмы и методы заражения

насекомых

Микроспоридии. В экспериментах по заражению насекомых использовали микроспоридий Vairimorpha ephestiae

(Microsporidia: Burenellidae). Споры микроспоридий были любезно предоставлены Ю.Я. Соколовой (ВНИИЗР, С.Петербург) . Личинок третьего возраста G. mellonella (на следующий день после линьки) заражали спорами V. ephestiae перорально - насекомых погружали в водную суспензию спор

(105 спор/мл) или в дистиллированную воду (контрольная группа личинок) комнатной температуры на 1 сек, после чего помещали на искусственную питательную среду. Заражение контролировали путем прижизненного микроскопирования жирового тела инфицированных и контрольных личинок с помощью фазово-контрастной оптики. Для определения процентного соотношения стадий развития микроспоридий производили подсчет среднего количества вегетативных стадий и спор на мазках жирового тела, окрашенных по Романовскому-Гимза.

Для заражения использовали третий возраст личинок, поскольку именно этот возраст насекомых является наиболее оптимальным для экспериментального заражения микроспоридиями. Кроме того, у гусениц младших возрастов затруднен отбор гемолимфы и извлечение органов, что было необходимо для исследований, проведенных в настоящей работе.

15

Предварительные результаты показали, что активность и спектр изучаемых детоксицируюших ферментов и антиоксидан-тов не изменяется у личинок, погружаемых в дистилированную воду на 1 сек по сравнению с нативными насекомыми, поэтому в качестве контроля мы использовали личинок, погружаемых в дистилированную воду.

Кристаллообразующие бактерии Bacillus thuringiensis. В опытах использовали высоковирулентный штамм 69-6 и невирулентный 280 акристаллофорный мутант Bacillus thuringiensis ssp.galleriae (Bt), ранее описанные в работах (Бурцева, 1970; Бурцева и др., 1973). Количество бактерий подсчитывали при последующем высеве бактериальной суспензии на рыбный агар (НПО «Питательные Среды», г.Махачкала). Пероральное заражение G. mellonella проводили при содержании личинок на питательной среде, в состав которой была добавлена спорокристаллическая суспензия Bt (1 мл суспензии, содержащей 1,8 х 109 бактерий/мл, смешивали с 3 г среды). Кроме того, интактным насекомым инъецировали в гемоцель 4 мкл суспензии убитых формалином вегетативных клеток Bt штамм 69-6 (суточная культура, 104 клеток на личинку), предварительно трижды промытых в 10 мМ фосфатном буфере рН 7.2 с 150 мМ NaCl (ЗФФР) . В качестве контроля инъецировали насекомым 4 мкл ЗФФР.

Личинкам совки М. brassicae инъецировали в гемоцель 4 мкл бактериальной суспензии Escherichia coli 5 х 105 бактерий на гусеницу. Вегетативные клетки бактерий (суточная культура) предварительно инкубировали в 4% формалине в течение 30 мин, затем трёхкратно промывали в ЗФФР (по 5 мин

16

при 3000 g) . В качестве контроля инъецировали насекомым 4 мкл ЗФФР.

Энтомопатогенные грибы. Грибы Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Paecilomyces fumosoroseus были выделены из погибших в естественных условиях насекомых. Чистые культуры патогенов поддерживали методом периодических пересевов на агаризованной среде Сабуро [Семенов, 1990] с 0.1% дрожжевым экстрактом. Для получения инфекционного материала грибы культивировали на пшене. Подготовку субстрата проводили согласно рекомендациям Е.А. Никольской [1982]. Грибы выращивали в течение 15-20 суток при 24 -26°С, затем водой производили смыв спор с носителя. Заражение насекомых осуществляли путем нанесения инфекционного материала на листья кормовых растений (контактно-перорально), обмакиванием в суспензию спор с титром 5х108/мл и методом отпечатков по Б.Н. Огаркову [1990] . В последнем случае насекомых на 15-20 мин помещали на колонии энтомопатогенных грибов, после чего их отсаживали во влажную камеру. Из погибших насекомых проводили реизоляцию патогена. Для этого трупы раскладывали на поверхность агаризованной питательной среды и инкубировали в термостате. Видовую принадлежность грибов устанавливали по микроскопическим признакам [Евлахова, 1974; Коваль, 191 A; Humber, 1997].

1.3. Приборы и реактивы

Определение оптической плотности инкубационной смеси при изучении ферментативной активности проводили на спек-

Список литературы
Цена, в рублях:

(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)		 1425
Скачать бесплатно 25185.doc 





Найти готовую работу


ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:


Связаться

Доставка любой диссертации из России и Украины

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ


Ссылки:

Выполнение и продажа диссертаций, бесплатный каталог статей и авторефератов

Счетчики:

Besucherzahler
счетчик посещений

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.