Бесплатно скачать, заказать диплом, курсовую, диссертацию Компьютерное моделирование активный центров моноаминоксидаз и создание ингибиторов с заданной селективностью

У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ

Сделать закладку на сайт

Заказать диплом, курсовую, диссертацию

Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Книга жалоб
и предложений

Название	Компьютерное моделирование активный центров моноаминоксидаз и создание ингибиторов с заданной селективностью

Количество страниц	226

ВУЗ	МГИУ

Год сдачи	2010

Бесплатно Скачать	25231.doc

Содержание	Содержание ОГЛАВЛЕНИЕ 1. Введение... 7 1.1. Актуальность проблемы... 7 1.2. Научная новизна и практическая значимость... 10 1.3. Апробация работы... 10 1.4. Основные положения, выносимые на защиту... 12 2. Обзор литературы... 13 2.1. Моноаминоксидаза... 13 2.1.1. Физиология МАО... 15 2.1.1.1. Распределение в клетках и тканях... 15 2.1.1.2. Функции МАО... 15 2.1.1.3. Регуляция... 18 2.1.2. Биохимия МАО... 21 2.1.2.1. Субстраты... 21 2.1.2.2. Механизмы и кинетика реакций, катализируемые МАО... 22 2.1.3. Молекулярная биология МАО... 28 2.1.3.1. Генная структура и локализация... 28 2.1.3.2. Функциональные участки... 31 2.1.3.2.1. Динуклеотид-связывающая область... 33 2.1.3.2.2. Первый дополнительный участок связывания ФАД... 36 2.1.3.2.3. Второй дополнительный ФАД-связывающий участок... 39 2.1.3.2.4. Активные центры МАО А и Б... 42 2.1.3.2.5. Другие функционально важные аминокислотные остатки... 46 2.1.3.2.6. Мембранный якорь... 46 2.1.3.3. Пространственная структура МАО Б... 51 2.1.3.4. Пространственная структура МАО А... 62 2.1.4. Медицинская химия МАО (ингибиторы)... 65 2.2. Методы компьютерного конструирования лекарств. Общие положения... 75 2.2.1. Прямые методы компьютерного конструирования лекарств ... 79 2.2.1.1. Скрининг баз данных низкомолекулярных соединений... 80 2.2.1.2. Конструирование новых лигандов молекулярно-графическими методами... 82 2.2.2. Непрямые методы конструирования лекарств... 83 2.2.3. Взаимосвязь разных подходов и их связь с экспериментом ... 89 2.2.4. Компьютерное моделирование МАО и ее ингибиторов... 92 2.3. Заключение... 94 3. Объекты и методы... 96 3.1. Объекты... 96 3.2. Методы... 98 4. Результаты... 103 4.1. Построение 3D-QSAR и CoMFA моделей активных центров МАО А и Б... 105 4.1.1. 3D-QSAR и CoMFA модели производных индола и изатина ... 106 4.12. 3D-QSAR и CoMFA анализ производных пиразинокарбазола .. 116 4.1.3. 3D-QSAR и CoMFA модели производных карбобензоксиэтиламина (КЭА), анилида Р-аланина (АА) и карбобензоксиэтилдиамина (КЭДА)... 133 4.2. Моделирование полости активного центра фермента... 142 4.2.1. Разработка подхода по моделированию полости активного центра фермента с неизвестной пространственной структурой . 142 4.2.2. Построение слепков МАО... 148 4.2.2.1. Построение слепка активного центра МАО А... 148 4.2.2.2. Построение слепка активного центра МАО Б... 155 4.2.2.3. Сопоставление слепка активного центра МАО Б с пространственной структурой фермента... 160 4.2.2.4. Сопоставление слепка активного центра МАО А с пространственной структурой фермента... 168 4.2.2.5. Оценка эффективности совместного использования моделей слепка активного центра и 3D-QSAR с CoMFA моделей... 171 4.2.2.6. Апробация подхода по поиску ингибиторов в молекулярных базах данных методом докинга в слепок... 173 4.3. Компьютерное моделирование и поиск новых ингибиторов МАО... 179 4.3.1. Поиск потенциальных ингибиторов МАО А методом молекулярного докинга в базе данных низкомолекулярных веществ... 179 4.3.2. Поиск ингибиторов МАО Б в молекулярной базе данных... 186 4.3.3. Поиск неселективных ингибиторов МАО... 189 5. Обсуждение... 201 6. Выводы... 224 7. Список научных работ, опубликованных по теме диссертации . 226 8. Список литературы... 232 9. Благодарности... 266 Введение 1. ВВЕДЕНИЕ 1.1. Актуальность проблемы. Развитие биомедицинской химии, связанной с теоретической и клинической медициной, требует изучения и анализа структуры и функций ключевых ферментов клеточного метаболизма. Одно из основных направлений в этих исследованиях связано с использованием компьютерных технологий для анализа данных, планирования экспериментов и обработки их результатов. Заметное место в этих подходах занимает компьютерное моделирование структуры биологических молекул, их взаимодействия друг с другом, поиск новых биологически активных соединений. Данная область исследований получила название «компьютерное конструирование лекарств» [Marrone et al, 1997; Zeng, 2000]. Использование компьютерных технологий для визуализации пространственных структур макромолекул, моделирования взаимодействия макромолекул с низкомолекулярными лигандами, оценки энергии взаимодействия, моделирования новых соединений и предсказания их свойств позволяет значительно ускорить создание новых лекарственных препаратов [Marrone et al, 1997; Zeng, 2000]. Одним из ключевых ферментов, участвующий в катаболизме медиаторных аминов в центральной нервной системе и периферических тканях, является моноаминоксидаза (МАО; К.Ф. 1.4.3.4). Несмотря на то, что этот фермент был открыт более 75 лет назад, он по-прежнему остается важным объектом фундаментальных и клинических исследований [Горкин, Медведев, 1995; Типтон, 1997]. Моноаминоксидаза является флавин-содержащим ферментом, локализованным во внешней мембране митохондрий. В организме млекопитающих МАО присутствует в двух формах - МАО А и МАО Б, которые кодируются разными, хотя и высоко гомологичными генами [Shin, et al., 1999; Abell, Kwan, 2001]. Эти формы различаются по чувствительности к ингибиторам и по преимущественному окислению субстратов [Горкин, Медведев, 1995; Wouters, 1998]. В организме МАО А и МАО Б, по-видимому, выполняют разные функции, на что указывают различная локализация ферментов в тканях и преимущественное окисление определенных субстратов [Abell, Kwan, 2001]. Изменение активности этого фермента обнаружено при многих нервно-психических расстройствах (болезни Паркинсона и Альцгеймера, депрессии и др.) [Wouters, 1998; Горкин, Медведев, 1995; Jegham, George, 1998 Yamada, Yasuhara, 2004]. Применение ингибиторов МАО в клинической практике дает выраженный терапевтический эффект и нормализацию состояния больных. Ингибиторы МАО А (такие как моклобемид, брофаромин, пиразидол, тетриндол и др.) нашли свое применение в качестве антидепрессантов, а некоторые ингибиторы МАО Б (например, депренил) применяются для лечения болезни Паркинсона [Cesura, Pletscher, 1992; Blanco et al., 2002; Chiap et al., 2002]. Возможно применение ингибиторов МАО в лечении алкогольной и никотиновой зависимостей [Domino, 1996; Farren et al., 1998]. Поэтому разработка новых ингибиторов этих ферментов остается актуальной задачей [Tipton, 1989; Типтон, 1997; Tipton, 2000]. Долгое время разработку новых эффективных ингибиторов МАО сдерживало отсутствие информации о пространственных структурах этих ферментов. Поэтому исследователи с помощью различных экспериментальных методов пытались выявить структурные особенности этих белков: были определены аминокислотные последовательности различных моноаминоксидаз, процентное содержание вторичных структур в белковой глобуле, место ковалентного связывания кофактора - флавинаденилдинуклеотид (ФАД) - с белком [Wouters, 1998]. В результате анализа последовательностей, конструирования химерных молекул и точечного мутагенеза были предсказаны участки белка, ответственные за нековалентное связывание флавинового кофактора [Zhou et al., 1995; Tsugeno et al., 1995; Chen et al., 1996; Grimsby et al., 1996]. Было установлено несколько ключевых аминокислот, ответственных за связывание субстрата и участие в катализе [Tsugeno, Ito, 1997; Geha et al., 2001; Cesura et al., 1998]. Однако использование косвенных экспериментальных данных не позволяло оценить структуру и свойства активных центров МАО А и МАО Б. Даже появившиеся в 2002 и 2004 годах пространственные структуры МАО Б [Binda et al., 2002] и МАО A [Ma et al., 2004] оставляют нерешенными многие вопросы об особенностях их взаимодействия с различными ингибиторами. Отсутствие данных о пространственных структурах этих ферментов и наличие большого числа обратимых и механизм-активируемых ингибиторов этих ферментов стимулировало активное применение методов компьютерного моделирования для анализа особенностей строения этих ферментов. Таким образом, к началу данного исследования, существовавшие данные о строении МАО А и МАО Б, не позволяли охарактеризовать пространственные структуры их активных центров, что значительно препятствовало поиску новых эффективных ингибиторов этих ферментов. Поэтому целью данной работы был компьютерный анализ структур активных центров моноаминоксидаз и разработка подходов для создания ингибиторов этих ферментов с заданной селективностью. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1. Проанализировать репрезентативные ряды низкомолекулярных лигандов МАО А и Б и определить общие черты и особенности структур лигандов для каждого типа ферментов. 2. Провести анализ структуры активных центров МАО А и Б методом 3D-QSAR с использованием ингибиторов, отличающихся механизмом действия и относящихся к разным химическим классам. 3. Разработать метод моделирования полости активного центра фермента с неизвестной трехмерной структурой и проверить корректность подхода на примере ферментов с известной пространственной структурой. 10 4. Построить модели активных центров МАО А и Б. 5. Провести поиск новых базовых структур ингибиторов МАО А и Б с заданной селективностью. 1.2. Научная новизна и практическая значимость. Впервые методами 3D-QSAR и CoMFA проанализировано несколько репрезентативных рядов ингибиторов МАО А и МАО Б (производных пиразинокарбазола, индола и изатина и карбобензоксиэтилами, анилида Р-аланина и карбобензоксиэтилдиамина) и построены модели активных центров этих ферментов. Предложена методика моделирования полости активных центров ферментов с неизвестной пространственной структурой для поиска новых ингибиторов в базах данных низкомолекулярных соединений. Показано, что локирование соединений в модель полости активного центра фермента с неизвестной пространственной структурой с последующей оценкой их активности по 3D-QSAR и CoMFA моделям является эффективным методом для поиска новых ингибиторов. Показана возможность создания нового поколения ингибиторов МАО, способных с одинаковой эффективностью тормозить оба типа этих ферментов в фармакологически значимом диапазоне концентраций. Найден ряд новых базовых структур селективных и неселективных ингибиторов МАО А и МАО Б, которые могут быть использованы для разработки новых антидепрессантов. 1.3. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на симпозиумах и конференциях: - IV Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1997); - The 2nd Electronic Molecular Graphics and Modelling Conference (MGM EC-2) on the Internet and World Wide Web (http://www.vei.co.uk/mgmec2/), (1997); 11 - 12 International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations (Montpellier, France, 1998); - 8th International Amine Oxidase Workshop. (Hungary, 1998); - V Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1999); - The Electronic Conference "Molecular Simulation'99" on the Internet and World Wide Web (http://molsim.vei.co.uk) (1999); - VI Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2000); - 9th International Amine Oxidase Workshop. Amine oxidases: enzymes with novel functions? (Barselone, 2000); - 7th international summer school on biophysics "Supramolecular structure and function" (Rovinj, 2000); - 4th INTAS Interdisciplinary Symposium on Physical and Chemical methods in Biology, Medicine, and Environment (Moscow, 2001); - IX Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2002); - I Национальная конференция «Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины», (Москва, 2002); - International conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine". (St.Petersburg-Moscow, 2002); - II Национальная конференция «Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины» (Москва, 2003); - 5th International Conference on Molecular Structural Biology (Vienna, 2003); - 2th International conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine". (Moscow-Pies-Moscow, 2004). а также на конкурсах научных работ ГУ НИИ БМХ РАМН (1999, 2001). 12 1.4. Основные положения, выносимые на защиту 1. Предложен подход для компьютерного анализа структур активных центров ферментов с неизвестной пространственной структурой и поиска новых базовых структур ингибиторов, включающий: а) анализ структур конкурентных обратимых ингибиторов с ограниченной конформационной подвижностью; б) преимущественную оценку стерического фактора, определяющего возможность размещения лиганда в активном центре; в) построение компьютерных моделей полости активного центра фермента, отражающих его форму и размеры; г) проверку достоверности моделей с использованием близких аналогов с разными размерами и отличающихся ингибиторной активностью; д) поиск лигандов в молекулярных базах данных с использованием таких моделей; е) экспериментальную проверку новых ингибиторов. Эффективность использования данного подхода была показана в прямых экспериментах на фармакологически важном объекте -моноаминоксидазах типа А и Б. 2. Построены модели активных центров МАО А и МАО Б (фармакофорные модели, 3D-QSAR и CoMFA модели и модели слепков активных центров ферментов), позволяющие охарактеризовать структурные особенности строения активных центров этих ферментов. 3. Обоснован и экспериментально проверен на примере моноаминоксидаз типа А и Б подход по компьютерному поиску новых базовых структур лигандов в базах данных низкомолекулярных соединений для ферментов с неизвестной пространственной структурой. С использованием предложенного подхода обнаружены новые селективные и неселективные ингибиторы МАО, которые могут быть использованы в качестве оригинальных базовых структур для разработки новых эффективных ингибиторов МАО. 4. Доказана принципиальная возможность создания нового поколения обратимых ингибиторов МАО, неселективно ингибирующих оба типа ферментов в фармакологически значимом диапазоне концентраций. 13 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Моноаминоксидаза. Многие физиологически активные вещества, участвующие в клеточном метаболизме, относятся к классу аминов. Они включают моноамины (серотонин, фенилэтиламин, тирамин, триптамин, дофамин, гистамин, адреналин, норадреналин и др.), диамины (путресцин, кадаверин) и полиамины (спермин, спермидин). Баланс аминов в организме и клетках поддерживается процессами их синтеза и разрушения. Ключевыми ферментами, участвующими в деградации аминов являются аминоксидазы, катализирующие реакцию окисления амина с помощью кислорода и воды до альдегида, аммиака и перекиси водорода: R-CH2 -NH2 + О2 +Н2О -* R-CHO + NH3 + Н2О2 В настоящее время известны два основных типа аминоксидаз, различающихся по структуре белка и типу кофактора, участвующих в реакции. Первый тип аминоксидаз представляет собой ферменты, содержащие простетическую группу флавинадениндинуклеотид (ФАД), второй тип содержит ионы меди и хинон в качестве кофакторов. Аминоксидазы широко распространены в живых организмах. Они обнаружены как в прокариотических, так и в эукариотических организмах. Причем каждый тип аминоксидаз встречается в обоих типах клеток. Так, у бактерий Escherichia coli это периплазматический фермент, содержащий в качестве кофакторов хинон и двухвалентную медь [Roh et al., 1995]. В бактериях Mycobacterium tuberculosis обнаружена флавин-содержащая аминоксидаза [Cole et al., 1998]. Из нитевидных грибов Aspergillus niger были выделены две аминоксидазы различных типов. Одна из них идентична медь-содержащей аминоксидазе с 6-гидроксидофахиноном в качестве кофактора в активном центре. Другая является флавопротеином (55 кДа), который по характерным свойствам близок к моноаминоксидазам млекопитающих [Schilling, Lerch, 1995; Сингер и др., 1997]. У форели показано наличие флавин-содержащей 14 аминоксидазы, для которой было предположено, что она является новым типом фермента [Wouters, 1998]. У млекопитающих обнаружено три типа аминоксидаз: моноаминоксидазы типа А и Б (флавин-содержащие) и семикарбазид-чувствительная аминоксидаза (SSAO) (медь-содержащая оксидаза) [Callingham et al., 1991; Lyles, 1996; Сквайерс, 1997; O'Sullivan et al., 2004]. Впервые фермент, осуществляющий дезаминирование тирамина, был обнаружен Хэйр в 1928 году в тканевом экстракте кролика и назван ею тираминоксидазой. Потом эту же аминоксидазу описали другие авторы в 1937 году под именами алифатическая аминоксидаза и адреналиноксидаза. В том же году Блашко с сотрудниками показали, что все эти три фермента являются одним и тем же белком и ввели для них название аминоксидаза [Jegham, George, 1998]. В 1938 году Е.Целлер обобщил данные по аминоксидазам и предложил их деление на моноаминоксидазу (катализирует окисление тирамина, адреналина и алифатических моноаминов) и диаминоксидазу (катализирует окисление гистамина и алифатических диаминов). В начале 1950-х годов Е.Целлер обнаружил специфические ингибиторы моноаминоксидазы. В 1960-х годах была установлена разная способность некоторых ингибиторов блокировать окисление различных субстратов. Это позволило Джонстон в 1968 году сформулировать гипотезу о множественности форм МАО (названных МАО А и МАО Б), отличающихся по субстратной специфичности и ингибиторной селективности (цит. по [Горкин, Медведев, 1995]). Однозначное доказательство наличия двух форм флавиновых моноаминоксидаз у млекопитающих было получено в 1988 году, когда были клонированы кодирующие ДНК из печени человека МАО А и МАО Б, были определены их нуклеотидные последовательности и рассчитаны их аминокислотные последовательности [Bach et al., 1988]. В последние два года многолетние усилия по кристаллизации и определению пространственных структур этих ферментов завершились 15 успешной расшифровкой структур МАО Б [Binda et al., 2002; Binda et al., 2003; Binda et al., 2004] и MAO A [Ma et al., 2004a, b]. 2.1.1. Физиология МАО. 2.1.1.1. Распределение в клетках и тканях. Моноаминоксидаза широко представлена во многих тканях нервной системы и периферических органов. Основные данные о распределении типов МАО по клеткам и тканям были получены с помощью моноклональных антител, различающих МАО А и МАО Б [Kochersperger et al., 1985; Denney et al., 1982a,6; Denney et al., 1983]. Иммуноцитохимическими методами было показано, что МАО А локализуется в плаценте и в печени, но не обнаруживается в тромбоцитах и лимфоцитах, в то время как МАО Б встречается в тромбоцитах, лимфоцитах и печени, но отсутствует в плаценте [Thorpe et al., 1987; Riley et al., 1989]. Это объясняется различной экспрессией двух форм МАО, что предполагает их независимую роль в передачи нейросигнала и в метаболизме аминов. Более детальное распределение форм МАО в различных тканях представлено в таблице 1. Содержание МАО А и Б может варьировать также в тканях одной системы. Иммуноцитохимический анализ локализации МАО А и МАО Б в мозгу приматов (обезьян и человека) показал, что эти формы фермента экспрессируются в различных нейронах с разной физиологической функцией [Westlund et al., 1985; Westhmd et al., 1988] (табл. 2). Было отмечено, что нейроны, содержащие МАО А, расположены в местах локализации катехоламинов, тогда как для нейроны, содержащие МАО Б, группируются около клеток, которые синтезируют и хранят серотонин [Luque et al., 1995]. 2.1.1.2. Функции МАО. Различное распределение в тканях, наблюдаемое для МАО А и Б, позволяет предсказать функции этих ферментов в периферических тканях и в мозгу. Так, в плаценте МАО А может снижать концентрацию биоактивных 16 Таблица 1. Распределение МАО в организме человека. [Berry et al., 1994]. Ткани МАО А МАО Б Плацента +К+) ± Фибробласты ++ + Тромбоциты - Лимфоциты - -н- Эритроциты - - Головной мозг ++ i_1 / i \ 1 Г1 Т^ I Тонкая кишка ++ ++ Толстая кишка -н- ++ Легкие 1_\| / i \ \ ) + Печень Сердце _]_\ ( \\ ++(+) Почки I [ / 1 \ V J Поджелудочная железа Скелетная мускулатура +/+++ ± + нет активности; очень низкая активность; низкая активность; средняя активность; высокая активность. Таблица 2. Концентрации МАО типа А и Б (пмоль/мг белка) в мембранных препаратах из различных участков мозга [Cesura, Pletscher, 1992]. Ткани нервной системы МАО А МАО Б Кора лобной доли 2,6 7Д Гипоталамус 5,2 17,8 Черная субстанция 2,4 13,3 Гипокампус 3,4 20,7 Мозжечок 2,5 5,6 17 аминов в плаценте, защищая плод от них. Тогда как МАО Б может защищать клетки и ткани от ксенобиотиков из окружающей среды или пищи. В мозгу эти формы фермента контролируют уровень нейротрансмитерных аминов. Однако распределение МАО А и МАО Б в катехоламинергических и серотонинергических нейронах оказалось неожиданным. В серотонинргических нейронах МАО Б не окисляет серотонин, несмотря на то, что концентрация этого соединения может достигать высокого уровня [Abell, Kwan, 2001]. При обычных условиях серотонин захватывается синаптическими везикулами, которые высвобождают его при передаче сигнала. Вероятнее всего, основной ролью МАО А и Б в нейронах является удаление или снижение концентраций аминов. Кроме этого, МАО Б, предпочитающая гидрофобные субстраты, участвует в защите клеток от ксенобиотиков. Однако было обнаружено, что некоторые ксенобиотики в результате окислительной модификации превращаются в более токсичные соединения. В частности, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП) под действием МАО превращается в нейротоксин, который разрушает допаминергические нейроны в черной субстанции [Bums et al., 1983] и вызывает симптомы, близкие к болезни Паркинсона у людей [Langston et al., 1983]. МФТП окисляется МАО Б в клетках глии и серотонинергических нейронах до нестабильного иона 1-метил-4-фенил-2,3-дигидропиридинина (МФДГГ), который спонтанно окисляется до высокореакционного токсического иона 1-метил-4-фенилпиридина (МФП+) [Chiba et al., 1984; Fritz et al., 1985]. Это соединение активно захватывается синаптосомами мозга через систему транспорта дофамина [Chiba et al., 1985]. Токсичность МФП* связывают с ингибированием НАДН-дегидрогеназы митохондрий [Heikkila et al., 1985]. Основной вклад in vivo в образование токсичного производного МФТП вносит МАО Б. Предобработка животных ингибиторами МАО Б (депренил, паргилин) защищает их от нейротоксического действия МРТР [Cohen et al., 1984; Langston et al., 1984], тогда как ингибитор МАО А (хлоргилин) не оказывает заметного эффекта [Heikkila et al., 1985]. Это позволило применить депренил в качестве препарата для лечения начальных

Список литературы

Цена, в рублях: (при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)	1425

Скачать бесплатно	25231.doc

Найти готовую работу

ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:

Связаться

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ

15.04.24 Задачи, условия и этапы организации экспериментальной работы

15.04.24 Критерии качества преподавания

15.04.24 Категория нормы в обучающей деятельности

Архив материала для курсовых и дипломных работ

Ссылки:

Счетчики:

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.