У нас уже 22238 рефератов, курсовых и дипломных работ
Заказать диплом, курсовую, диссертацию


Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Понравилось
Не понравилось





Книга жалоб
и предложений


 






Название Влияние поверхностно—активный веществ и полисахаридов на ферментативную активность растительной фосфолипазы D
Количество страниц 96
ВУЗ МГИУ
Год сдачи 2010
Бесплатно Скачать 22948.doc 
Содержание Содержание
Список сокращений 4

Введение 5

Глава 1. Литературный обзор 9

1.1. Амфифилы и их классификация 9

1.1.1. Характеристика синтетических поверхностно-активных 10 веществ

1.1.2. Распространение, структура и функция фосфолипидов 14

1.1.3. Агрегатное состояние фосфолипидов в водном растворе 16

1.1.4. Воздействие поверхностно-активных веществ на 19 агрегатное состояние фосфатидилхолина в растворе

1.2. Типы фосфолипаз 22

1.2.1. Распространение, локализация и функции фосфолипазы 27 D

1.2.2. Методы выделения и очистки фосфолипазы D 29

1.2.3. Молекулярные характеристики фосфолипазы D 33

1.2.4. Гидролитическая активность фосфолипазы D 35

1.2.5. Трансферазная активность 39

1.2.6. Кинетика и механизм реакций 40

1.3. Взаимодействие поверхностно-активных веществ с 43 белками

1.4. Взаимодействие полисахаридов с белками 44 Глава 2. Материалы и методики эксперимента 51

2.1.1. Материалы 51

2.1.2. Выделение фосфолипазы D 54 2.2. Методы исследований 55

2.2.1. Приготовление липидных везикул 55

2.2.2. Определение гидролитической активности 55

2.2.3. Определение холина рейнекатным методом 56

3

2.2.4. Определение содержания белка в препаратах 56 фосфолипазы D

2.2.5. Съемка УФ-спектров растворов 54

2.2.6. Измерение мутности растворов 57

2.2.7. Потенциометрические измерения растворов 57

2.2.8. Реологические измерения растворов 58 Глава 3. Влияние поверхностно-активных веществ на 59

ферментативную активность фосфолипазы D 3.1 Характеристики препаратов фосфолипазы D 59

3.2. Влияние поверхностно-активных веществ на активность 62 фосфолипазы D

3.3. Действие солей кальция на ферментативную активность 67 фосфолипазы D

3.4. Влияние соосаждения фосфолипазы D кальциевыми 70 солями анионных поверхностно-активных веществ на ее активность

3.5. Механизм воздействия анионных поверхностно- 74 активных веществ на фосфолипазу D

Глава 4. Влияние полисахаридов на ферментативную 83

активность фосфолипазы D

Заключение 92

Выводы 94

Список литературы 96

Введение



Список сокращений

ККМ - критическая концентрация мицеллообразования

ФЛ - фосфолипид

ФХ - фосфатидилхолин

ФК - фосфатидная кислота

ФЭ - фосфатидилэтаноламин

ФС - фосфатидилсерин

ФГ — фосфатидилглицерин

ФИ - фосфатидилинозитол

ДФГ - дифосфатидилглицерин

СМ - сфингомиелин

ПАВ - поверхностно - активные вещества

ДДС - додецилсульфат натрия

ДДОС - додецилдиоксиэтиленсульфат натрия

ЦТАБ - цетилтриметиламмоний бромид

КАЭФ - керамидаминоэтилфосфонат

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ММ - молекулярная масса

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГОЭЦ - гидроксиэтилцеллюлоза

Кат-ГОЭЦ - катионный заместитель гидроксиэтилцеллюлозы

Кат-ГФГОЭЦ и ГФ-кат-ГОЭЦ - гидрофобно модифицированные производные

ГОЭЦ

Введение

Актуальность работы. Фосфолипаза D (фосфатидилхолин фосфатидогидролаза ЕС 3.1.4.4) относится к группе важных ферментов, которые в живых системах выполняют разнообразные функции от усвоения питательных веществ до синтеза биологически активных соединений. Фосфолипаза D проявляет прежде всего гидролитическую активность, в результате которой происходит расщепление сложноэфирной связи между остатком фосфатидной кислоты и спирта в молекулах фосфолипидов (ФЛ). При этом последний замещается на водород, но возможен перенос остатка фосфатидной кислоты на самые разные гидроксилсодержащие акцепторы, что представляет большой интерес для биотехнологии, так как трансфосфатидилирующая активность фосфолипазы D, как показано в работах Виджика и Аурича с соавт. (Wijk et al, 1992; Aurich et al, 1997; Aurich et al, 2002), может быть использована для синтеза разнообразных лекарственных препаратов.

К особенностям фосфолипаз и фосфолипазы D, в частности, относятся условия их функционирования. Поскольку субстрат сосредоточен в биологических мембранах или мембранных органеллах, они проявляют наибольшую активность на границе раздела фаз. Когда ФЛ находятся в растворе в виде мономеров, ферментативная активность оказывается на минимальном уровне, но резко возрастает после перевода ФЛ в агрегированное состояние (Wilton, Waite, 2002). Другим важным фактором, регулирующим активность фосфолипазы D в растворе, является наличие поверхностно-активных веществ (ПАВ). Введение анионных ПАВ в состав реакционной смеси практикуется с первых работ после обнаружения фермента (Dawson, Hemington, 1967; Quarles, Dawson, 1969), поскольку в их присутствии увеличивается как скорость, так и степень гидролиза ФЛ. Между тем, механизм воздействия ПАВ на фосфолипазу D до настоящего

6

времени не установлен. Понимание особенностей функционирования фосфолипазы D в средах с агрегированным субстратом и роли ПАВ представляет значительный интерес как для фундаментальной, так и прикладной науки, поскольку касается ее эффективного использования в биотехнологии.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в выяснении механизма воздействия ПАВ на активность фосфолипазы D и роли агрегатного состояния субстрата в функционировании фермента.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

1. Выяснить механизм воздействия различных ПАВ (анионных, катионных и с разными полярными группами) на активность фосфолипазы D из белокачанной капусты в присутствии фосфатидилхолина (ФХ) как субстрата реакции, изменение ее структуры и связывание ПАВ, используя различные физико-химические методы (светорассеяние, УФ-спектроскопию и потенциометрию с ионоселективным электродом на ПАВ).

2. Исследовать функциональную активность фосфолипазы D в водных растворах с ФХ, находящимся в виде мицелл и везикул, для выяснения зависимости функционирования фермента от агрегатного состояния субстрата.

3. Установить характер воздействия гидрофобно модифицированных полисахаридов, являющихся полимерным аналогом ПАВ, на активность и структуру фосфолипазы D с помощью различных физико-химические методов (светорассеяния, УФ-спектроскопии и динамической реологии) и провести их сопоставление с низкомолекулярными ПАВ.

Научная новизна работы. Впервые систематически исследовано влияние ПАВ на гидролитическую активность растительной фосфолипазы D, что позволило предложить механизм их регулирующего воздействия на

7

функционирование фермента, в котором белковая макромолекула приобретает оптимальную структуру в результате ее конформационных перестроек под воздействием введенных веществ. Установлена схожесть в воздействии ПАВ и изменения рН среды на третичную структуру и активность фосфолипазы D.

Впервые установлено, что полисахариды оказывают заметный эффект на функционирование фосфолипазы D. Показано, что в отличие от низкомолекулярных ПАВ анионный полисахарид оказывал ингибирующий эффект, тогда как катионные полисахариды и ПАВ взаимодействовали с фосфолипазой D различным образом. Обнаружено, что воздействие гидрофобно модифицированных полисахаридов на функционирование фермента определяется местом нахождения углеводородных радикалов в макромолекуле, которые присоединяются либо к заряженным функциональным группам, либо к основной цепи, располагаясь независимо от этих групп. Рассмотрен возможный механизм влияния полисахаридов на третичную структуру и активность фосфолипазы D.

Практическая значимость работы. Предложенный в диссертации механизм воздействия ПАВ на фосфолипазу D позволяет подбирать оптимальные условия для функционирования фермента и прогнозировать его поведение в реакционных средах. Установление характера зависимости гидролитической активности фосфолипазы D от агрегатного состояния субстрата и рН среды может быть использовано для оптимизации ферментативных процессов в биотехнологии. Повышение активности фермента в присутствии катионных полисахаридов, включая гидрофобно модифицированные, позволяет предложить их в качестве альтернативы ПАВ, поскольку при использовании полимеров упрощается очистка продуктов реакции.

На защиту выносятся:

- влияние различных ПАВ на гидролитическую активность фосфолипазы D,

- регулирование активности фосфолипазы D изменением агрегатного состояния субстрата и рН среды,

- механизм воздействия ПАВ на активность фермента,

- воздействие анионного, катионного и гидрофобно модифицированных полисахаридов на гидролитическую активность фосфолипазы D.

Апробация работы. Основные положения были представлены и доложены на региональной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы морской биологии и экологии" (Владивосток, 1998); 12th Conference of the European Colloid and Interface Society, Dubrovnik-Covtat, Croatia, 1998. Fist International symposium "Self-Assembly of Amphiphilic Systems", Dresden, 1998.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в научных журналах.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждения, заключение, выводы и список литературы, содержащий 152 ссылки. Работа изложена на 110 страницах, содержит 7 таблиц, 27 рисунков.

Благодарности. Выражаю искрению благодарность своим научным руководителям д.х.н. Ю.А. Щипунову, к.х.н. Шумилиной Е.В. и д.б.н. Э.Я. Костецкому за огромную и неоценимую помощь на всех этапах выполнения работы, а также анализа полученных результатов.
Список литературы
Цена, в рублях:

(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)
1425
Скачать бесплатно 22948.doc 





Найти готовую работу


ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:


Связаться

Доставка любой диссертации из России и Украины



Ссылки:

Выполнение и продажа диссертаций, бесплатный каталог статей и авторефератов

Счетчики:


© 2006-2016. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.