У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ
Заказать диплом, курсовую, диссертацию


Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Понравилось
Не понравилось





Книга жалоб
и предложений

 





Название Изменение липиднозо состава перитонеальнын макрофагов и ик ядер при апоптозе и некрозе
Количество страниц 110
ВУЗ МГИУ
Год сдачи 2010
Бесплатно Скачать 22972.doc 
Содержание Содержание
ВВЕДЕНИЕ... 6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ... 10

1.1. Макрофаги... 10

1.1.1. Морфологические особенности и молекулярно- 10 генетическая организация макрофагов...

1.1.2. Реактивность макрофагов как механизм, регулирующий воспаление... 13

1.2 Апоптоз и некроз - две формы гибели клетки 17

1.3. Роль липидов в апоптозе и некрозе... 25

1.3.1. Липидыядра... 25

1.3.2. Роль липидов в рецепции и внутриклеточной сигнализации. 28

1.3.3. Перекисное окисление липидов и его роль в реализации программы апоптоза и некроза... 33

1.4. Роль липополисахаридов, активных форм кислорода и медиаторов воспаления в апоптозе и некрозе макрофагов... 37

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ... 43

2.1. Материалы... 43

2.2. Методы... 43

2.2.1 Объект исследования... 43

2.2.2. Получение перитонеальных макрофагов... 44

2.2.2.1. Постановка эксперимента... 44

2.2.3. Выделение ядер ПМФ... 45

2.2.4. Определение жизнеспособности клеток... 45

2.2.5. Экстракция липидов из ПМФ и их ядер... 46

2.2.6. Определение диеновых, триеновых коньюгатов и малонового диальдегида в ПМФ и их ядрах... 46

с

2.2.7. Фракционирование липидов в тонких слоях силикагеля и их количественное определение... 47

2.2.8. Определение активности СОД и каталазы в ПМФ и их ядрах...-----... 49

2.2.9. Определение концентрации общего белка в ПМФ и их ядрах... 50

2.3. Выделение и электрофорез ДНК макрофагов в агарозном

геле...____... 51

2.3.1. Приготовление агарозного геля...52

2.3.2. Определение концентрации ДНК...__53

2.3.3. Световая и флуоресцентная микроскопия ПМФ...53

2.3.4. Окрашивание по Паппенгейму-Крюкову... 54

2.3.5. Окрашивание акридиновым оранжевым... 54

2.3.6. ОкрашиваниеHoechst33258... 55

2.3.7. Статистическая обработка данных... 55

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ... 56

3.1 Влияние перекиси водорода и ЛПС Е. coli на гибель пери-

тонеальных макрофагов... 56

3.2. Влияние перекиси водорода и ЛПС Е. coli на спектр липи- дов перитонеальных макрофагов и их ядер... 65

3.3. Изменение окисленности липидов при Н2О2 и ЛПС Е. coli -индуцируемой гибели ПМФ... 75

3.4. Влияние Н2Ог и ЛПС Е. coli на активность некоторых анти-оксидантых ферментов... 82

3.5. Влияние модификаторов фосфоинозитидного цикла на гибель перитонеальных макрофагов... 88

3.6. Влияние модификаторов Са2+-проницаемости на Н2О2-индуцированный апоптоз перитонеальных макрофагов...93

с

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ... 97

* ВЫВОДЫ...108

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 110

Введение



СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АО - антиоксиданты; АФК - активные формы кислорода; ГДФ-гуанозин дифосфат;

ГТФ - гуанозин трифосфат;

GM-CSF — гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующий фактор;

1,2 ДАГ- 1,2 диацилглицерол;

ДК — диеновые конъюгаты;

ИЛ - интерлейкин;

П*з — инозитол (1,4,5) трифосфат;

у-ИФН - гамма-интерферон;

* Са2+ - ионы кальция;

КТ-каталаза;

ЛПС - липополисахарид;

МДА - малоновый диальдегид;

НАДФН — никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный;

НТС - нитросиний тетразолий;

ПМФ — перитонеальные макрофаги;

Н2О2 - перекись водорода;

ПКС - протеинкиназа С;

ПОЛ - перекисное окисление липидов; ^ СОД - супероксиддисмутаза;

ТК - триеновые конъюгаты;

TGF В - трансформирующий ростовой фактор Р;

ФНО-а - фактор некроза опухоли а;

ФМСФ - фенилметансульфонил фторид

ФИзК — фосфатидилинозитол-3-киназа;

ФЛС - фосфолипаза С;

ФИ-цикл - фосфоинозитидный цикл; "# ЭДТА - этилендиаминтетрацетат.

1?

Введение

Актуальность проблемы. В формировании и функционировании многоклеточного организма, принимают участие две формы клеточной гибели — некроз и апоптоз, имеющие морфологические, биохимические и генетические особенности. Некроз ассоциируется с действием вредоносных агентов и факторов, характеризуется нарушением целостности клеточной мембраны. Апоптоз, как генетически детерминированный процесс гибели реализуется при наличии внешних стимулирующих сигналов и внутренних предпосылок, связанных с появлением нерепарируемых повреждений ДНК.

В последние годы получены веские доказательства участия липидов не только в функционировании клеточных мембран, но и в молекулярной орга-низации хроматина и хромосом, в регуляции генетических процессов — транскрипции и репликации (Слюсарь Н. Н., 1999; Стручков В. А., 2000; Martelli A. M. et al., 2004). В ядре обнаружены сигнальные системы, включая фосфоинозитидный и сфигномиелиновый циклы (Marshall С. J., 1995; Alan W., Ulrich M, 2002). Важной формой участия липидов в межклеточной стимуляции является то, что модификация липидного микроокружения рецепторов изменяет их чувствительность (Белоконева О. С., 1993; Проказова Н. В. и др.,1998; Самуилов В. В., 2000; Gordon S. et al., 1995). Очевидно, что изменения в обмене липидов могут играть важную роль в регуляции клеточных процессов, включая и ядерную активность. При этом нарушения липидного гомеостаза, обусловленные активизацией процессов пероксидации липидов и фосфолипазами, приводящие к изменению клеточного статуса, в конечном итоге могут способствовать апоптозу или некрозу клетки (Егорова А. Б. и др., 2001; Butthe Т. М., Sadstrom Р. А ., 1994; Hale A. J. et al., 1996).

Для изучения роли липидов в реализации программы апоптоза и некроза подходящим объектом выступают перитонеальные макрофаги, которые являются реактивными клетками, реализующими широкий спектр функциональных возможностей при воспалении (Щербаков В. И., 1990; Зубова С. Г.,

Окулов В. Б., 2001). При этом в очаге воспаления перитонеальные макрофаги функционируют в среде, содержащей в больших количествах активные формы кислорода и липополисахариды, мишенями действия которых могут выступать липиды (Пескин А. В., 1996; Weinstein S, L., et al., 1991; Vesy C. J., 2000). Известно, что при воспалении в МФ усиливается липидныЙ метаболизм, усиливаются процессы пероксидации липидов (Gordon S. et al., 1997). Макрофаги отвечают на воздействие разнообразных агонистов, быстро гид-ролизуя мембранные фосфолипиды, что приводит к генерации большого числа внутриклеточных и экстраклеточных мессенджеров, в результате чего реализуется многофункциональный потенциал этих клеток (Клебанов Г. И., Владимиров Ю.А., 1999). Одним из наиболее ранних событий, запускаемых в макрофагах при воспалительных реакциях, является активация сигнальных путей с участием фосфоинозитидспецифической фосфолипазы С и фосфоли-пазы Аг, играющих ключевую роль в хемотаксисе, секреции, фагоцитозе (Попова Е. Н. и др., 2002; Rao D.M. et al., 1995; Lee S. В., Rhee S. G., 1995; Yoshinori N., 2002).

Таким образом, ПМФ являются функционально активными клетками и снижение их активности приводит к снижению эффективности воспалительного процесса. Очевидно, что поврежденные ПМФ должны быть элиминированы.

В связи с этим, представлялось целесообразно исследовать изменения в спектре липидов перитонеальных макрофагов и их ядер при индуцированной гибели клеток перекисью водорода и липополисахаридом из Е. Coli.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении изменений состава липидов перитонеальных макрофагов и их ядер при апоптозе и некрозе.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние перекиси водорода и ЛПС Е. coli на апоптоз и некроз перитонеальных макрофагов.

2. Исследовать изменение спектра липидов перитонеальных макрофагов и их ядер при Н2О2 и ЛПС Е. coli индуцируемой гибели клеток. ^ 3. Исследовать активность процессов перекисного окисления липидов

и ключевых антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы и каталазы) в перитонеальных макрофагах и их ядрах при Н2О2 и ЛПС Е. coli индуцируемой гибели клеток.

4. Изучить влияние модификаторов фосфоинозитидного цикла на гибель перитонеальных макрофагов.

5. Изучить влияние модификаторов Са2+-проницаемости на Н2С>2-индуцированный апоптоз и некроз перитонеальных макрофагов..

Научная новизна работы. Впервые проведено широкое комплексное

исследование липидного компонента перитонеальных макрофагов и их ядер Mi

при апоптозе и некрозе. Показано, что перекись водорода в концентрации 1

мМ и ЛПС Е. coli в концентрации 1 мкг/мл вызывают гибель перитонеальных макрофагов преимущественно путем апоптоза. Определена склонность перитонеальных макрофагов к гибели по пути апоптоза или некроза при соответствующих изменениях в спектре липидного компонента клеток и их ядер, при изменении активности процессов перекисного окисления липидов: и ключевых антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы и каталазы) макрофагов. С помощью модификаторов ФИ-цикла показано, что нарушение . в обмене ФИ-цикла является одной из причин толкающих клетку на путь апоптоза; выявлено влияние модификаторов Са2+-проницаемости на Н2О2-индуцированный апоптоз и некроз перитонеальных макрофагов. Положения, выносимые на защиту:

1. Перекись водорода и ЛПС Е. coli дозозависимым образом стимулируют апоптоз и некроз перитонеальных макрофагов.

2. Перестройки в спектре липидов перитонеальных макрофагов и их ядер происходят при развитии как апоптотического так и некротического

^ процесса, индуцируемого перекисью водорода и ЛПС Е. coli.

3. Перекись водорода и ЛПС Е. coli усиливают процессы пероксидации липидов и снижают антиоксидантную защиту перитонеальных макро-

Iй* фагов и их ядер, что провоцирует их гибель.

4. В реализации программы апоптоза перитонеальных макрофагов важную роль играют ФИ-цикл и ионы Са2+.

Теоретическая и практическая значимость работы. Данные проведенного комплексного исследования вносят существенный вклад в решение фундаментальной проблемы биологии клетки — проблемы молекулярных механизмов гибели клетки, расширяя представления об участии липидов в апоптозе и некрозе. Эта область исследований имеет не только теоретическую, но и практическую значимость. На основании динамики изменения со-

н

держания индивидуальных липидов можно выявлять склонность клетки к

апоптозу или некрозу.

Практическую ценность имеют данные о влиянии перекиси водорода, ЛПС Е. coli, модификаторов ФИ-цикла и Са2+-проницаемости на гибель перитонеальных макрофагов. Полученные данные позволяют рекомендовать использование перекиси водорода как эффективного индуктора апоптоза, выявляющего и элиминирующего популяцию клеток с генетическими повреждениями.

Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, были ^ доложены на международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001 г), на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино-на-Оке, 2003 г.), на III Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Диз-регуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004 г.), на ежегодных Огаревских чтениях (научных конференциях Мордовского госуниверситета) (Саранск, 2001, 2003, 2004 г.), на международной научной конференции «Современные медицинские технологии» (Хорватия, У маг, 2004 г.).
Список литературы
Цена, в рублях:

(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)		 1425
Скачать бесплатно 22972.doc 





Найти готовую работу


ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:


Связаться

Доставка любой диссертации из России и Украины

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ


Ссылки:

Выполнение и продажа диссертаций, бесплатный каталог статей и авторефератов

Счетчики:

Besucherzahler
счетчик посещений

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.