Бесплатно скачать, заказать диплом, курсовую, диссертацию Исследование низкотемпературной динамики Белков методом выжигания провалов

У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ

Сделать закладку на сайт

Заказать диплом, курсовую, диссертацию

Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Книга жалоб
и предложений

Название	Исследование низкотемпературной динамики Белков методом выжигания провалов

Количество страниц	100

ВУЗ	МГИУ

Год сдачи	2010

Бесплатно Скачать	23197.doc

Содержание	Содержание Введение...3 Глава 1. Модели низкотемпературных релаксационных процессов в стеклах, полимерах и белках...12 Модель двухуровневых систем (ДУС)...12 Модель диффузионного движения...20 Основные выводы...24 Глава 2. Экспериментальная установка и спектроскопические методики исследования низкотемпературных релаксационных процессов в белках: метод выжигания провалов...25 Метод выжигания провалов...26 Исследование спектральной диффузии во временной шкале...30 Термические циклы...33 Исследование временной и температурной стабильности спектрального провала...34 Глава 3. Исследование флуктуационных и релаксационных процессов в белках при низких температурах...37 Объекты исследования и их свойства...37 Неоднородное уширение в белках...46 Равновесная и неравновесная спектральная диффузия в белках...49 Тепловые циклы...64 Форма провала...74 Исследование стабильности фотопродукта на основе измерения стабильности спектрального провала...81 Заключение...90 Список рисунков...91 Список таблиц...92 Список литературы...93 Благодарности...100 Введение «Одной из основных задач исследования белка является выявление связи между структурой, энергетическим ландшафтом, динамикой и его биологической функцией». Г.Фрауенфельдер В последние десятилетия интерес к биологическим объектам возрос не только в связи с развитием и потребностями медицины и биотехнологии, но и потому, что эти объекты обладают уникальными физическими и химическими свойствами. Физическая структура белков отличается от структуры классических объектов исследования физики конденсированных сред: кристаллов, жидкостей, стекол, и потому представляет специальный интерес для физических исследований. Белки представляют собой биополимерные цепочки, состоящие из ограниченного набора аминокислот, последовательность которых задает первичную структуру белка. Число аминокислот в белках может насчитывать более сотни, а характерный размер и вес белков может варьировать в широких пределах. Одной из главных особенностей белков является компактная трехмерная структура, приобретаемая в процессе „схлопывания" биополимерной цепочки. Расположение атомов в такой структуре характеризуется упорядоченностью, которая может быть классифицирована как вторичная, третичная и четвертичная структура [1]. Одним из наглядных примеров вторичной структуры является спиралевидная форма белковой молекулы. Трехмерная атомная структура многих белков хорошо известна. Однако в масштабе меньше 0.2 А структура белка характеризуется беспорядком [2,3]. Упорядоченная структура белков ответственна за их биологическую функциональность, тем не менее, наличие беспорядка также имеет огромное значение и играет важную роль, к примеру, в процессе сворачивания биополимерной цепочки [4]. Именно такая специфичность: наличие порядка и беспорядка в белках выделяет их как отдельные объекты исследования, свойства которых лежат между кристаллическим и аморфным состоянием. Изучение структуры биологических кристаллов выявило ряд особенностей, отличающих их от «обычных» кристаллов. Так, среднеквадратичное отклонение от равновесного положения <х2>, усредненное по одному и тому же классу атомов для разных аминокислот, сильно отличается [2,3]. С понижением температуры амплитуда колебаний <х2> уменьшается, однако даже при гелиевых температурах <х2> значительно больше величины, соответствующей квантовомеханическим колебаниям решетки. В пионерских работах по рентгеноструктурному анализу белковых кристаллов было высказано предположение, что при низких температурах среднеквадратичное отклонение <х > определяется неупорядоченностью, вызванной существованием различных конформационных состояний белка [2,3]. Концепция конформационных состояний в белке также подтвердилась в кинетических исследованиях методом фотолиза [5]. Различные конформационные состояния отличаются друг от друга небольшой реорганизацией структуры белка за счет изменения взаимного расположения атомов. В каждом из таких состояний белок способен выполнять биологическую функцию, скорость которой может варьировать. Конформационные состояния в белках образуют иерархическую структуру. Состояния, имеющие значительные структурные отличия, относят к уровню низкого (нулевого) порядка. К примеру, в СО - миоглобине такие состояния связаны с положением связи СО по отношению к плоскости гем - группы белка [6]. Число таких конформационных состояний невелико, конформеры разделены высокими энергетическими барьерами. Уровни высокого порядка характеризуются большим набором конформационных состояний, которые разделены более мелкими энергетическими барьерами [7]. На многомерной потенциальной поверхности (энергетический ландшафт) конформационные состояния белка образуют энергетические минимумы. Белок неотделимо связан с окружением, в котором он находится, поэтому энергетический ландшафт зависит не только от положения атомов в самом белке, но в него дает вклад и гидратационный слой, образованный за счет взаимодействия аминокислот белка с молекулами растворителя. Классификация конформационных состояний является важным шагом в понимании структуры энергетического ландшафта белка. При физиологических температурах переходы между конформационными состояниями необходимы для протекания биологических процессов. По температурной зависимости среднеквадратичного отклонения <х2> можно анализировать конформационные движения в белке на временной шкале эксперимента. Методами мессбауэровской спектроскопии и нейтронного рассеяния был обнаружен динамический переход между гармоническим и ангармоническим поведением <х2> колебаний атомов белка [8,9] . Резкое возрастание <х2> в области температуры Т«200 К связано с конформационным движением боковых групп в биополимерной цепочке и подвижностью молекул воды в гидратационном слое белковой молекулы. В исследованиях кинетических процессов в белках спектроскопическими методами при физиологических температурах была обнаружена широкая дисперсия скоростей релаксаций, характерная для стеклообразного состояния [10]. В ходе исследования фотоиндуцированных релаксационных процессов и релаксационных процессов, вызванных воздействием давления, в белках была обнаружена неэкспоненциальная временная зависимость конформационной динамики [11,12]. Детальные исследования релаксационных процессов в белках выявили также влияние свойств растворителя на динамику белка [13,14]. Понижение температуры приводит к замедлению релаксационных процессов в белках и „замораживанию" конформационной динамики. Такое „замораживание" релаксационных процессов служит весьма эффективным средством исследования сложных систем, каковыми являются белки, и широко используется в их изучении. Температурная зависимость релаксационных процессов в замороженных белках может быть, аналогично температурах белки также проявляют аномальные свойства, аналогичные свойствам стекол. Например, в кристалле миоглобина была обнаружена линейная зависимость теплоемкости от температуры [15]. В оптических спектрах белков было обнаружено явление спектральной диффузии, которое является также и одним из характерных свойств низкотемпературных примесных стекол. Спектральная диффузия (СД) - это проявление в оптических спектрах примесей (хромофоров) процессов структурных релаксаций, идущих в стеклообразных матрицах. Эффективные исследования СД, а с нею и низкотемпературных релаксаций в стеклах, полимерах, а также и в биологических объектах, стали возможны в результате появления методов селективной спектроскопии, в первую очередь метода выжигания провалов [16-21]. Метод выжигания провалов в неоднородно уширенных спектрах поглощения хромофоров получил широкое распространение и интенсивно используется, в частности, для изучения явления спектральной диффузии в неупорядоченных и частично упорядоченных примесных молекулярных системах [22,23]. Он весьма эффективен при изучении медленных релаксационных процессов во временной шкале, покрывающей интервал от секунд до нескольких дней или недель. СД, как и другие аномальные низкотемпературные свойства стекол, весьма успешно описывается моделью двухуровневых систем (ДУС) [24 - 26]. Но это описание, несмотря на его успешность, не является вполне удовлетворительным по ряду причин. Во-первых, оно - чисто феноменологическое и ничего не говорит о микроскопической природе ДУС. Во-вторых, оно пригодно только для описания неупорядоченных систем при низких температурах (как правило, ниже 4 К). В этой связи интерес к созданию более общих теорий, описывающих поведение неупорядоченных систем в более широком диапазоне температур и учитывающих их микроскопическую структуру, сохраняется и реализуется время от времени в создании моделей, альтернативных модели ДУС. Одним из факторов, усложняющих создание теоретических моделей аморфных систем, является универсальность поведения стекол при низких температурах. Упрощая, можно сказать, что органические и неорганические стекла и полимеры при совершенно разной химической и даже физической структурах демонстрируют существенно схожие свойства, сильно отличающиеся от свойств кристаллов, как органических, так и неорганических. В этом отношении белки являются интересным объектом, как бы находящимся между стеклами и кристаллами. С одной стороны, белок имеет хорошо определенную структуру, с другой стороны, в нем проявляются динамические свойства неупорядоченных систем. Наличие порядка в белках делает их отличными от низкотемпературных стекол. Можно ожидать, что исследование низкотемпературных релаксаций в белках, их сравнительный анализ по отношению к стеклам могут помочь понять связь между микроскопической структурой объекта и его низкотемпературными свойствами, как для белков, так и для стекол. Весьма важным свойством белков является также влияние растворителя на их низкотемпературную динамику [27-29]. Исследование этого влияния может помочь в понимании микроскопических механизмов низкотемпературных релаксаций в белках, находящихся во взаимодействии с матрицей. В этой связи была поставлена первая задача диссертации, а именно: исследование влияния матрицы на спектральную диффузию в белках при низких температурах и анализ данных в рамках известных моделей. В настоящее время существует несколько альтернативных моделей СД. Их экспериментально проверяемые предсказания во многом совпадают, что затрудняет сравнение этих моделей. Одним из экспериментально проверяемых предсказаний является «форма диффузионного ядра», которая отличается в разных моделях. Исследование формы спектральных провалов может дать важную информацию как о механизмах взаимодействия хромофора с белком и растворителем, так и помочь в выборе адекватной модели. В этой связи была поставлена вторая задача диссертационной работы - исследование формы провала, уширенного за счет спектральной диффузии. Очень важную информацию о структуре и конформационных превращениях в белке можно получить из исследований его энергетического ландшафта. Низкотемпературные данные, дающие наиболее важную информацию об этой структуре вблизи энергетического минимума, весьма скудны на сегодняшний день. Третьей' задачей диссертации было: исследование с помощью спектральной диффузии, индуцированной термическими циклами, энергетического ландшафта некоторых белков. Исследование низкотемпературных флуктуационных и релаксационных процессов в белках позволяет глубже понять низкотемпературную динамику в биологических объектах и ее связь с энергетическим ландшафтом. Выбранное направление исследований определяет актуальность диссертационной работы. Научная новизна работы 1. Установлено, что спектральная диффузия в твердых белковых растворах в значительной степени определяется релаксационными процессами в стеклообразной матрице. Обнаружена связь между температурой стеклования растворителя и пространственной структурой белка с одной стороны и характеристиками СД с другой стороны. 2. Обнаружена и интерпретирована корреляция между величиной неоднородного уширения в оптических спектрах хромофора в белке и скоростью диффузионного уширения провала. Предложена модель неоднородного уширения в оптических спектрах хромофора, отражающая структурное состояние белка. 3. В исследуемых белках экспериментально обнаружены специфические энергетические барьеры, предположительно связанные с участием водородных связей в движении аминокислот между конформационными состояниями. 4. Обнаружены изменения формы спектрального провала в ходе тепловых циклов. В качестве возможной причины наблюдаемого эффекта предложена гипотеза, связывающая эти изменения с дисперсией скорости спектральной диффузии в образце. Практическая значимость • Обнаруженное влияние релаксационных процессов в стеклообразной матрице на спектральную диффузию в твердых белковых растворах существенно меняет представление о низкотемпературной динамике в белках. • Установленная корреляция между спектральной диффузией и структурным состоянием белка дает важную информацию для построения более совершенной теории релаксационных процессов в белках и других неупорядоченных и частично упорядоченных системах. • Характеристики обнаруженных в исследованных белках специфических энергетических барьеров являются исключительно важным источником информации при анализе структуры этих белков и конформационных движений в них. Структура и краткое содержание работы Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, списка рисунков, таблиц, литературы и раздела благодарностей. Глава 1 носит обзорный характер. В ней представлены два класса моделей релаксационных процессов в неупорядоченных средах при низких температурах: модель ДУС и диффузионная модель. В Главе 2 описываются основные методики для изучения флуктуационных и релаксационных процессов в неупорядоченных матрицах на основе метода выжигания провалов. Экспериментальные данные представлены в Главе 3. В этой части диссертации проведен анализ СД в белках в рамках двух моделей: модели ДУС и модели диффузионного движения. В рамках модели ДУС проанализировано влияние стеклующейся матрицы на параметры модели для белка с различной степенью структурного беспорядка. В рамках модели диффузионного движения рассмотрена взаимосвязь между спектральной диффузией и неоднородным уширением в оптических спектрах белков. Проведены спектроскопические исследования зависимости неоднородного уширения от структуры белка. Проведено исследование распределения энергетических барьеров в конформационном пространстве белка. Проанализировано влияние неоднородной матрицы на форму выжженного провала. Проведено исследование свойств фотопродуктов в белке путем измерения стабильности спектрального провала как функции температуры и времени. В Заключении сформулированы основные результаты и выводы диссертационной работы. Положения, выносимые на защиту 1. Показано, что спектральная диффузия в твердых растворах белков с гем-группой в аморфных матрицах при низких температурах определяется как динамическими свойствами самого белка, так и динамическими процессами в матрице. 2. Обнаруженные специфические энергетические барьеры являются проявлением устойчивых характерных особенностей структуры конформационного пространства исследованных белков, играющих существенную роль в их динамике. Апробация работы и публикации Основные результаты диссертационной работы были доложены на собрании немецкого научного общества Sonder Forschung Bereich 533 (2004 г.) во Фрайзинге (Германия) и международной конференции «Dynamics of Proteins» (2004 г.) во Фрайзинге (Германия), а также на научных семинарах Института спектроскопии РАН и Технического Университета Мюнхена. Список печатных работ по теме диссертационной работы приведен в конце диссертации и автореферата. Глава 1. Модели низкотемпературных релаксационных процессов в стеклах, полимерах и белках Модель двухуровневых систем (ДУС) Основные положения стандартной модели ДУС Для объяснения аномальных свойств низкотемпературных стекол была предложена модель ДУС [24,25]. Эта модель связывает низкотемпературные свойства стекол с локализованными низкоэнергетическими состояниями на многомерной потенциальной поверхности (Рис.1 а), формально описываемыми двухъямными потенциалами с двумя состояниями, имеющими широкое распределение энергий. Два параметра - асимметрия двухъямного потенциала А и параметр туннелирования X определяют энергию возбуждения ДУС: Здесь матричный элемент До =Шехр(-Х) зависит от параметра туннелирования X и средней колебательной энергии Ю в одном из минимумов двухъямного потенциала (Рис.16). Параметр туннелирования А. определяется микроскопическими параметрами системы: X = —J2mV0 , где d - характерный размер ДУС, Vo - высота энергетического барьера и т - масса туннелирующей частицы. В первых же работах [24,25] была предложена простая феноменологическая функция распределения ДУС по основным параметрам, объяснявшая наблюдаемую экспериментально линейную температурную зависимость теплоемкости стекол [30] и примерно логарифмический рост ее со временем при температурах ниже 1 К: Р(Л,Х) = const, которую мы в дальнейшем будем называть стандартной функцией распределения. Этот выбор функции распределения оказался настолько удачным, что модель ДУС просуществовала в неизменном виде более 20 лет. Исследование диэлектрических свойств стекол [31] и последующие оптические исследования [32,33] обнаружили у ДУС электрические дипольные моменты, которые, по-видимому, играют существенную роль во взаимодействии ДУС с другими состояниями и, в частности, примесными центрами. обобщенную координату Q; б) двухъямный потенциал, образующий двухуровневую систему. Взаимодействие ДУС с примесными центрами в стекле приводит к появлению спектральной диффузии в оптических спектрах, о которой пойдет речь в следующем параграфе. Спектральная диффузия в рамках модели ДУС Явление спектральной диффузии неразрывно связано с релаксационными процессами, протекающими в неупорядоченных матрицах. Изучение спектральной диффузии в оптических спектрах примесных стекол и замороженных белков стало возможно с разработкой методов селективной спектроскопии [16]. Наибольшую популярность при исследовании СД приобрел метод выжигания провалов [17,18]. С помощью метода выжигания стабильных провалов можно исследовать СД в интервале от секунд до нескольких дней и даже недель. Этот метод был использован в качестве основного экспериментального метода в настоящей работе, его методические основы будут кратко изложены в следующей главе. Основа явления СД состоит в том, что частота поглощения хромофора, внедренного в матрицу, испытывает спонтанные скачки. В низкотемпературных стеклах это изменение частоты поглощения объясняется взаимодействием хромофора с ДУС. Теоретический анализ показал, что при выполнении ряда условий: а) диполь-дипольном взаимодействии между ДУС и примесными молекулами, б) однородном пространственном распределении ДУС, с) отсутствии заметной дисперсии взаимодействия между ДУС и примесными молекулами, изначально выделенный монохроматический ансамбль частот переходов молекул хромофора будет уширяться таким образом, что диффузионное ядро будет иметь лоренцеву форму [26]. Температурная и временная зависимости ширины диффузионного ядра Г определяется выражением: Х,А где С - усредненный параметр взаимодействия хромофор-ДУС, a n(t,T) -вероятность ДУС перейти в другое состояние в момент времени /. Усреднение производится по всем возможным значениям А, и А. Для равновесного ансамбля ДУС температурная зависимость п(Т) описывается выражением: а временная зависимость n(t,T) определяется выражением: n(t,T) = «(Г)(1-ехр(-г(?,Д0,Г)/)), (4) где r(E,A0,T) = FA20E-coth(------) - скорость релаксаций ДУС за счет 2квТ однофононного процесса туннелирования, F - константа ДУС-фононного взаимодействия. После усреднения по ансамблю ДУС с функцией распределения Р(А,Л) = const получается примерно линейная температурная и логарифмическая временная зависимость спектральной диффузии: где Гщах = г(Е — До) - максимальная скорость релаксаций ДУС с энергией Е, соответствующая случаю симметричного двухъямного потенциала. Методом. выжигания провала можно измерить диффузионное уширение провала за время наблюдения t, которое в рамках модели ДУС имеет зависимость вида: Модель ДУС в первоначальном варианте описывала свойства равновесного ансамбля ДУС.-Приведенные выше выражения описывают СД, вызванную равновесным флуктуационным обменом энергией между ансамблем ДУС и фононной подсистемой. Однако низкотемпературные стекла и замороженные белки являются неэргодическими системами. В таких системах наряду с равновесными процессами также протекают неравновесные (релаксационные) процессы. Последние вызваны охлаждением системы до криогенных температур и являются диссипативными по природе, т.е. их интенсивность и, в частности, вклад в спектральную диффузию, уменьшаются со временем. Типичными проявлениями таких процессов в стеклах являются остаточное тепловыделение [34,35] и эффект старения в спектральной диффузии [18,36]. Описание релаксационных процессов в неупорядоченных средах в общем виде является очень сложной и пока нерешенной задачей. Очевидно, релаксационное поведение системы должно зависеть не только от ее текущих физических параметров, но и от сценария ее приведения в текущее состояние. Неизбежный сценарий всех низкотемпературных экспериментов - это охлаждение образца от комнатной температуры до рабочей. Именно при таком сценарии и проявляются наиболее ярко указанные выше релаксационные эффекты. Оказалось, что весьма удовлетворительное описание эффекта старения в СД может быть достигнуто введением всего лишь одного дополнительного параметра - т.н. эффективной температуры Teff , которая имеет смысл некой средней температуры ансамбля неравновесных ДУС сразу после охлаждения образца [36]. С учетом неравновесного состояния ансамбля температурная зависимость вероятности изменить состояние ДУС будет иметь вид: l-tanhl^hanhl-Jp-l f (7) которая в случае Т = Тед- совпадает с выражением (3). Неравновесная компонента вероятности nne(T,Tejj) = п(Т,Тед) - п(Т) соответствует релаксационным переходам, ведущим к приближению температуры ансамбля ДУС к температуре фононной подсистемы. Вклад релаксационных переходов в спектральную диффузию определяется выражением: где ta -время, прошедшее с момента охлаждения образца до выжигания провала (время старения), см. подробнее в [18,36]. Таким образом, в рамках модели ДУС мы имеем три временных участка, на которых флуктуационные и релаксационные процессы имеют разный вклад в спектральную диффузию. Данные интервалы зависят от соотношения времени наблюдения t и времени старения ta. В случае, когда t» ta и Т« Teff, неравновесная компонента преобладает над равновесной. Спектральная диффузия имеет логарифмическую временную зависимость и не зависит от рабочей температуры Т. Если t~ta, то равновесная и неравновесная компоненты имеют сопоставимый вклад. При t«ta равновесная компонента будет давать основной вклад в спектральную диффузию. Отклонения от стандартных предположений модели ДУС Исследования спектральной диффузии в полимерах при температурах, близких к температуре жидкого гелия, выявили ряд отклонений от стандартных предположений модели ДУС: а) отличие функции распределения Р(Л,Л) от «стандартной»; б) отклонения контура

Список литературы

Цена, в рублях: (при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)	1425

Скачать бесплатно	23197.doc

Найти готовую работу

ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:

Связаться

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ

15.04.24 Задачи, условия и этапы организации экспериментальной работы

15.04.24 Критерии качества преподавания

15.04.24 Категория нормы в обучающей деятельности

Архив материала для курсовых и дипломных работ

Ссылки:

Счетчики:

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.