Бесплатно скачать, заказать диплом, курсовую, диссертацию Аффинные сорБенты для лечения сердечно-сосудистык заболеваний

У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ

Сделать закладку на сайт

Заказать диплом, курсовую, диссертацию

Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Книга жалоб
и предложений

Название	Аффинные сорБенты для лечения сердечно-сосудистык заболеваний

Количество страниц	280

ВУЗ	МГИУ

Год сдачи	2010

Бесплатно Скачать	23423.doc

Содержание	Содержание Список сокращений... 6 I ВВЕДЕНИЕ... 8 II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ... 12 III МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ... 61 1. Выделение антигенов... 62 1.1. Выделение липопротеидов... 62 1.1.1. Выделение ЛНП из плазмы крови человека. 1.1.1.1. Ультрацентрифугирование в ступенчатом градиенте плотности нейтральной соли бромида натрия. 1.1.1.2. Зональное ультрацентрифугирование. 1.1.1.3. Аффинная хроматография. 1.1.2. Выделение Лп(а). 1.1.2.1. Трехступенчатое ультрацентифугирование в ступенчатом градиенте плотности с последующей гель-фильтрацией. 1.1.2.2. Аффинная хроматография. 1.1.3. Получение ЛВП и делипидированной плазмы. 1.2. Очистка препарата IgG человека... 66 2. Получение антител... 67 2.1. Получение поликлональных антител... 67 2.1.1. Иммунизация животных. 2.1.2. Выделение ПкАт к ЛНП. 2.1.3. Выделение ПкАт к Лп(а). 2.1.3.1. Получение моноспецифической антисыворотки. 2.1.3.2. Очистка антител. 2.1.4. Препаративная очистка ПкАт. 2.2. Получение моноклональных антител (МкАт)... 69 2.2.1. Гибридизация и скрининг гибридомных клеток. 2.2.2. Выделение моноклональных антител из асцитной жидкости. 2.2.3. Выделение МкАтиз культуральной жидкости. 2.2.4. Препаративная очистка МкАт. 3. Синтез аффинных сорбентов... 71 3.1. Активация матриц... 71 3.1.1. Активация бромцианом. 3.1.2. Периодатное окисление. 3.2. Иммобилизация белков... 72 3.2.1. Иммобилизация липопротеидов 3.2.2. Иммобилизация антител. 3.3. Синтез сорбентов для процедур терапевтического афереза. 73 4. Определение сорбционной емкости иммуносорбентов... 73 4.1. Метод колоночной хроматографии... 73 4.2. «Batch» метод... 74 5. Анализ чистоты и специфичности белков... 74 5.1. Электрофоретические методы... 74 5.1.1. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. 5.1.2. Электрофорез в геле агарозы. 5.2. Иммунологические методы... 76 5.2.1. Метод двойной радиальной иммунодиффузии. 5.2.2. Иммуноэлектрофорез. 5.2.3. Иммуноблотинг. 5.3. Аналитическое ультрацентрифугирование... 77 6. Методы определения концентрации белков липидов... 77 6.1. Иммуноферментные методы... 77 6.1.1. Синтез конъюгатов антител с пероксидазой. 6.1.2. Определение концентрации антител к ЛНП. 6.1.3. Определение концентрации антител к Лп(а). 6.1.4. Определение концентрации антител к IgG. 6.1.5. Определение концентрации Лп(а) в плазме (сыворотке) крови человека. 6.1.6. Определение титра антител к иммуноглобулинам барана или мыши в плазме крови человека. 6.2. Определение концентрации Лп(а) методом радиальной иммунодиффузии по Манчини... 80 6.3. Определение концентрации апоВ в плазме крови... 81 6.4. Определение концентрации иммуноглобулинов G в плазме крови человека... 81 6.5. Определение концентрации суммарного белка... 81 6.6. Определение концентрации холестерина... 82 6.7. Определение концентрации холестерина в клетках... 82 7. ЛНП аферез in vitro на клеточной модели... 82 7.1. Получение образцов органных и клеточных культуры аорты человека... 82 7.2. Культивирование короткоживущей органной и клеточной культур из аорты человека... 83 7.3. ЛНП аферез in vitro на клеточной модели... 83 8. Микроскопическое исследование матриц... 83 9. Контроль качества при производстве колонок для клинического применения... 83 9.1. Определение стерильности... 83 9.2. Испытание на пирогенность... 84 9.2.1. Испытание на пирогенность на кроликах. 9.2.2. Испытание на пирогенность с использованием ЛАЛ теста. 9.3. Контроль частиц сефарозы в смывах с колонок... 86 9.4. Определение свободного белка в смывах с сорбента... 87 10. Проведение процедуры афереза с использованием иммуносорбционных колонок... 88 IV РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ... 90 1. Иммуносорбенты для ЛНП афереза... 90 1.1. Выделение и характеристика антигена - ЛНП плазмы крови человека... 91 1.2. Иммуносорбент с ПкАт к ЛНП... 97 1.2.1. Получение ПкАт к ЛНП. 1.2.2. Характеристика ПкАт к ЛНП. 1.2.3. Синтез и характеристика иммуносорбента с ПкАт для ЛНП афереза. 1.3. Иммуносорбент с моноклональными антителами к ЛНП... 107 1.3.1. Получение и характеристика МкАт к ЛНП. 1.3.2. Свойства иммуносорбентов с МкАт к ЛНП. 1.3.3. Синтез иммуносорбента с МкАт для клинического применения. 1.4 Доказательство эффективности ЛНП афереза в опытах in vitro... 124 1.5. Синтез и характеристика иммуносорбента для гемосорбции... 128 1.5.1. Выбор матрицы для гемосорбции. 1.5.2. Синтез и характеристика гемосовместимого сорбента для ЛНП афереза. 1.6. Сравнение сорбентов для ЛНП афереза... 138 1.6.1. Сравнение сорбентов, применяемых для ЛНП афереза в процедурах плазмосорбции. 1.6.2. Сравнение сорбентов, применяемых для ЛНП афереза в процедурах гемосорбции. 1.7. Результаты использования иммуносорбентов для ЛНП афереза в клинике... 159 2. Иммуносорбент для Лп(а) афереза... 168 2.1. Выделение и характеристика препарата Лп(а)... 168 2.2. Получение и характеристика ПкАт барана к Лп(а) человека... 173 2.3. Синтез и свойства иммуносорбента с ПкАт к Лп(а) человека... 177 2.4. Специфический Лп(а) аферез - новый подход к экстракорпоральной коррекции повышенного уровня Лп(а)... 184 2.5. Проведение процедур сочетанного ЛНП и Лп(а) афереза... 191 3. Сорбент с иммобилизованными ЛНП плазмы крови человека... 194 3.1. Изучение эффекта «атерогенности» при помощи сорбента с иммобилизованными ЛНП плазмы крови человека... 195 3.2. Клиническое применение сорбента с иммобилизованными ЛНП плазмы крови человека... 201 4. Иммуносорбент для афереза иммуноглобулинов у больных дилатационной кардиомиопатией... 206 4.1. Выделение и характеристика препарата IgG человека... 207 4.2. Получение и характеристика ПкАт барана против IgG человека... 210 4.3. Синтез и характеристика иммуносорбента с ПкАт против IgG человека... 211 4.4. Разработка дизайна процедур Ig афереза с использованием колонок с анти-Ig сорбентом... 218 4.5. Первый опыт лечения больных ДКМП методом иммуносорбции на колонках «Ig Адсопак»®... 223 5. Вопросы безопасности и технология производства аффинных колонок для терапевтического афереза... 230 V ЗАКЛЮЧЕНИЕ... 237 VI ВЫВОДЫ... 242 VII СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ... 246 VIII ПРИЛОЖЕНИЯ... 280 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. В настоящей работе использованы следующие сокращения: GMP - Good Manufacturing Practice IgA — иммуглобулины класса А IgG - иммуноглобулины класса G IgM - иммуноглобулины класса М HAT- среда - среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин М - среднее m - арифметическая ошибка SDS - додецилсульфат натрия SD - стандартное отклонение PMSF - фенилметилсульфонил-фторид апо(а) - апобелок(а) апоВюо - апобелок Вюо Ат - антитела Бис-акриламид - И^-метилен-бис-акриламид БСА - бычий сывороточный альбумин ВЭМ - велоэргометрия ГЛП - гиперлипопротеидемия ДС — декстрансульфат ИБС - ишемическая болезнь сердца ИМ - инфаркт миокарда ИС - иммуносорбенты ИФА - метод твердофазного иммуноферментного анализа КАГ - коронароангиография КБС - коронарная болезнь сердца КДР ЛЖ - конечный диастолический размер левого желудочка КДР ПЖ - конечный диастолический размер правого желудочка КСО ЛП - конечный систолический объем левого предсердия КСО ПП - конечный систолический объем . правого предсердия КШ - коронарное шунтирование ЛВП - липопротеиды высокой плотности ЛП - липопротеиды Лп(а) - липопротеид(а) Лп(а) аферез - удаление Лп(а) из плазмы крови пациента в экстракорпоральной процедуре иммуносорбции с использованием сорбента, содержащего в качестве лиганда моноспецифические поликлональные антитела барана к Лп(а) человека ЛНП - липопротеиды низкой плотности ЛНП аферез - удаление ЛНП из плазмы крови пациента в экстракорпоральной процедуре иммуносорбции с использованием иммуносорбента с Пк или Мк Ат против ЛНП человека. ЛОНП - липопротеиды очень низкой плотности МкАт - моноклональные антитела СГХС -,. семейная гиперхолестеринемия ООП - объем обработанной плазмы OXC - общий холестерин ОЦП - объем циркулирующей плазмы ПААГ - полиакриламидный гель ПкАт - поликлональные антитела РИА - радиоиммунный анализ РИД - метод простой радиальной иммунодиффузии ТАП - тканевой активатор плазминогена ТГ - триглицериды ТЕМЕД - тетраметилэндиамин Трис - трис-(гидроксиметил) аминометан ТХУ - трихлоруксусная кислота ХС-ЛВП - холестерин липопротеидов высокой плотности ХС-ЛНП - холестерин липопротеидов низкой плотности ХС-ЛНПкор - коррегированный уровень ХС-ЛНП, рассчитанный по формулен Фридвальда с модификацией Далена. ЭДТА - этилендиамин- тетрауксусная кислота ЭКГ - электрокардиография ФБ - фосфатный буфер ФВ ЛЖ - фракция выброса левого желудочка ЭП МБП - экспериментальное предприятие медико-биологических препаратов КНЦ. ВВЕДЕНИЕ. История вопроса и актуальность проблемы. Появление и накопление в крови человека различных патогенных веществ приводит к возникновению и развитию многих заболеваний. Такими веществами могут быть: аутоантитела, циркулирующие иммунные комплексы, атерогенные липопротеиды, эндогенные и экзогенные токсины, прионы, вирусы, и микроорганизмы. Их полное удаление или снижение концентрации, как правило, дает положительный клинический эффект. В частности, одной из задач терапии атеросклероза, связанного с нарушением липидного обмена, является снижение концентрации атерогенных апоВюо-содержащих липопротеидов в крови пациента. Основное направление терапии при аутоиммунных заболеваниях - удаление патогенных аутоантител или антигенов. Традиционным подходом к лечению в ситуациях, когда необходимо снизить концентрацию тех или иных веществ, является лекарственная терапия. Однако, в ряде случаев, она имеет ограничения в применении. Кроме того, для некоторых патологий, лекарства, эффективно снижающие концентрацию патогенных веществ в крови, отсутствуют. Поэтому поиск и разработка новых эффективных способов снижения концентрации и выведения их из крови больных с использованием современных методов биохимии, иммунологии, молекулярной биологии и биотехнологии до сих пор остается актуальной задачей. Существует много методов экстракорпорального очищения крови. Согласно классификации, предложенной в 1990 году Borberg, указанные методы можно разделить по степени специфичности удаления патогенного компонента. Значительная часть методов относится к сорбционным технологиям, то есть базируется на использовании различных сорбентов. Наиболее простым методом является плазмаферез, при котором часть циркулирующей плазмы больного удаляется и замещается раствором альбумина, донорской плазмой или кристаллоидными растворами. Плазмаферез широко и успешно используется и в настоящее время, особенно при острых ситуациях. Вместе с тем, специфичностью этот метод не обладает. На рисунке 1 представлена иерархия специфичности различных экстракорпоральных методов. Следующие в пирамиде специфичности методы, основанные на принципах фильтрации, осаждения или ионообменной хроматографии, используются достаточно широко, но тоже имеют высокий процент неспецифического удаления различных компонентов крови. Максимальную специфичность можно достичь при использовании аффинных сорбентов, особенно при использовании высокоспецифичных белок-белковых взаимодействий типа: фермент-субстрат, лиганд-рецептор, пептид-лиганд, антиген-антитело. В основе работы аффинных сорбентов используется принцип хроматографии по сродству. Работа в области создания высокоспецифичных аффинных сорбентов привела к созданию иммуносорбентов (ИС) для клинического применения, которые занимают место на вершине иерархии специфичности (рис.1). В русскоязычной литературе существует много терминов, которые определяют область медицины, в которой используются различные технологии очищения крови. Это «гемосорбция» и «гравитационная хирургия крови» [Лопухин, 1978-1985], «эфферентная терапия» [Костюченко, Гуревич, Соколов 2003], «гемокоррекция» или «экстракорпоральная гемокоррекция» (те же авторы), «экстракорпоральные методы лечения» [Коновалов, 2001]. В настоящей работе мы будем пользоваться термином «терапевтический аферез», потому что за годы становления этой области термин «Therapeutic apheresis» стал общепризнанным в международной литературе. Методы терапевтического афереза находят широкое применение в современной медицине. Накоплено немало примеров успешного применения сорбционных технологий для лечения сердечно-сосудистых и аутоиммунных заболеваний, печеночной недостаточности, в акушерстве и гинекологии, при трансплантации органов, в дерматологии, онкологии, ревматологии, при острой интоксикации и инфекции организма (рис.2.) В результате становления и развития этого направления медицины, стало очевидным, что разработка высокоспецифичных сорбентов для клинического применения, которые могут быть успешно, безопасно и эффективно использованы для очистки крови имеет большое научно- практическое значение. Наша работа посвящена созданию аффинных сорбентов для лечения больных с рефрактерными к иным видам терапии формами нарушений липидного обмена и дилатационной кардиомиопатией [ Покровский, 2004]. Пионерами в области сорбционных технологий очистки крови в России были Юрий Михайлович Лопухин и созданный им коллектив II МОЛГМИ им. Пирогова [ Лопухин, 1978; Лопухин и Молоденков, 1985]. В последнем абзаце книги «Холестериноз», вышедшей в 1983 году Юрий Михайлович Лопухин и соавторы писали: «Создание такого рода сорбентов (специфичных к ЛНП — примечание автора) позволит одномоментно удалять из крови почти полностью липопротеиды низкой плотности и таким образом способствовать выходу холестерина из клеток и тканевых депо. Эффективность подобного рода методов подтверждают и данные по использованию иммуносорбентов на апопротеиды липопротеидов низкой плотности в некоторых зарубежных клиниках. Вероятно, в ближайшем будущем именно на этом пути терапии атеросклероза клиницистов ждут наибольшие успехи» [Лопухин и др., 1983]. Фактически в то же время, в 1982 году, в КНЦ РАМН и была начата наша работа. Цель и задачи работы. Цель настоящей работы — создать новое поколение высокоспецифичных аффинных сорбентов для экстракорпорального удаления из крови человека патогенных веществ и исследовать особенности их применения при лечении больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, резистентными к лекарственной терапии. Экспериментальные задачи: 1. Синтезировать, характеризовать и апробировать в клинике сорбент с моноспецифическими поликлональными (ПкАт) барана против липопротеидов низкой плотности (ЛНП) человека. Исследовать эффективность и безопасность использования такого сорбента в процедурах экстракорпорального удаления ЛНП (ЛНП аферез). 2. Получить и характеризовать панель моноклональных антител (МкАт) против ЛНП человека. Показать принципиальную возможность использования МкАт для синтеза иммуносорбентов с целью их применения в терапевтическом аферезе. 3. Создать in vitro модель ЛНП афереза и с помощью такой модели исследовать его эффективность на органной и клеточной культурах аорты человека. 4. Сравнить различные типы сорбентов для ЛНП афереза. Изучить особенности их взаимодействия с плазмой крови человека. 5. Исследовать связь липопротеида(а) [Лп(а)] с наличием и тяжестью атеросклеротических поражений артерий различных локализаций. 6. Синтезировать, характеризовать и провести клинические испытания иммуносорбента для специфического удаления из плазмы крови человека Лп(а). Изучить возможность и эффективность использования такого сорбента для лечения больных ИБС с повышенным содержанием Лп(а). 7. Изучить возможность и особенности синтеза аффинных сорбентов с иммобилизованными антигенами на примере сорбента с ЛНП человека. 8. Синтезировать, характеризовать и показать принципиальную возможность использования иммуносорбента для удаления патогенных аутоантител из крови больных дилатационной кардиомиопатией в процедурах эктракорпорального удаления иммуноглобулинов человека (Ig аферез). 9. Разработать технологию создания колонок с аффинными сорбентами для процедур терапевтического афереза. Сорбционные технологии в лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Сердечно-сосудистые заболевания занимают одно из первых мест в ряду причин смертности населения в развитых странах среди которых Россия, к сожалению, лидирует по этому показателю. (Рис.3.). Безусловно, основной причиной этих заболеваний является атеросклероз, на понимание механизмов возникновения которого и поиск методов борьбы направлены усилия ученых всего мира. Гипотеза об основополагающей роли холестерина в возникновении и развитии атеросклероза, выдвинутая в начале XX века Аничковым Н.Н. и Халатовым С.Н. [Anitschkow, 1913], воплотилась в настоящее время в практически общепризнанную «липидную теорию» патогенеза атеросклероза [Kannel et al. 1971, Myant 1981, Assmann et al. 1992,]. Основное положение этой теории базируется на утверждении, что повышение уровня холестерина атерогенных классов липопротеидов в крови приводит к возникновению, развитию и прогрессированию атеросклеротических поражений сосудов и является причиной возникновения сердечно-сосудистых заболеваний и преждевременной смерти от осложнений атеросклероза, даже в отсутствии других факторов риска. Убедительным доказательством справедливости липидной гипотезы возникновения атеросклероза является семейная гиперхолестеринемия (СГХС). Это заболевание связано с мутацией гена, расположенного в 19 хромосоме и кодирующего белок-рецептор ЛНП [Goldstein and Brown, 1982, 1983]. В норме рецептор ЛНП играет основную роль в их катаболизме. Дефицит рецепторов приводит к накоплению ЛНП в плазме крови, что и наблюдается у больных СГХС практически с рождения. Уровень общего холестерина (ОХС) у гомозигот составляет 18.4-20.3 ммоль/л [Томпсон, 1989]. Если дефект гена имеется у одного родителя, то у детей возникает гетерозиготная форма СГХС - она встречается у 2 - 3 человек на тысячу среди населения развитых стран. Если генетический дефект присутствует у обоих родителей, то рождаются дети с гомозиготной формой СГХС, частота встречаемости которой - 1 на миллион населения. СГХС Иа типа - это природой созданная модель атеросклероза на человеке. Прогноз течения этого заболевания - неблагоприятный. Больные с гомозиготной формой обычно погибают в I - II декадах жизни от тягчайшего атеросклероза, а с гетерозиготной формой - во II — III декадах. Современная, даже агрессивная, гиполипидимическая лекарственная терапия, часто оказывается малоэффективной для нормализации уровня ОХС у таких больных. Гомозиготная форма СГХС характеризуется появлением уже в детском возрасте кожных ксантом и ксантом сухожилий, быстро прогрессирующим атеросклерозом и внезапной смертью в возрасте до 30 лет, как правило, от острой коронарной недостаточности. Именно попытка решить проблему снижения уровня холестерина у больных СГХС, привела в 80-х годах прошлого века к возникновению области медицины, названной впоследствии терапевтическим аферезом. Все методы терапевтического афереза, разработанные для удаления ЛНП, их авторы и исследователи, которые внесли наибольший вклад в их развитие, представлены в таблице 1. Таблица 1. Лферез липидов. Хронология Первым и старейшим методом терапевтического афереза, не потерявшим однако свою актуальность до наших дней, является плазмаферез. Считается, что приоритет создания метода плазмафереза принадлежит группе американских ученых из Балтимора под руководством J. Abel, опубликовавших статью «Plasma removal with return of corpuscles (Plasmapheresis) в журнале «Journal Pharmacology», 5 том за 1913-1914 годы [Abel et al., 1913-1914]. Однако, первой работой, описывающей принцип плазмафереза, была статья профессоров военно-медицинской академии Санкт-Петербурга Вадима Александровича Юревича и Николая Константиновича Розенберга: «К вопросам о промывании крови вне организма и о жизненной стойкости красных кровяных шариков», опубликованная годом раньше, в журнале «Русский врач» № 14 стр. 6. (Рис.4). Это - типичный пример, когда приоритет принадлежит авторам, которые публикуют работу в англоязычных журналах, в то время как бесспорно более ранние аналогичные работы наших ученых, опубликованные в русских журналах, к сожалению не цитируются [Соколов А.А., 2003]. Возможность использования плазмафереза для лечения больных СГХС была впервые показана во Франции, профессором De Gennes [De Gennes et al., 1967]. Впоследствии Thompson G.L. в Лондоне добился хороших результатов в Однако невозможность удаления большого количества плазмы пациента ограничивала эффективность плазмафереза, а проблема замещения удаленной плазмы донорской или альбумином, по мере распространения заболеваний, передающихся с кровью, представляла все большую опасность для пациента. Тем не менее, успехи применения плазмафереза стимулировали развитие новых подходов и технологий терапевтического афереза. В течение короткого промежутка времени, чуть больше 10 лет, возник целый ряд разработок, который обеспечил новый виток развития этой области медицины. Новые разработки устраняли один из основных недостатков плазмообмена — необходимость использовать замещающие растворы альбумина или донорской плазмы и, в той или иной степени, решали проблему селективности удаления липопротеидов низкой плотности (ЛНП). ЛНП аферез. Возникновение и развитие. Новая эра в развитии терапевтического афереза ознаменовалась в начале 80-х годов появлением сообщений об использовании в клинике аффинного сорбента с иммобилизованным гепарином [Lupien et al., 1976], каскада из двух плазмофильтров [Agichi et al., 1980], сорбента с поликлональными антителами барана против апо В белка ЛНП [Stoffel et al., 1981], системы, позволяющей удалять ЛНП из плазмы путем осаждения их гепарином (HELP) [Wieland and Seidel, 1983], сорбента с иммобилизованным декстрансульфатом [Yokoyama et al., 1984]. Три из перечисленных методик были основаны на использовании сорбентов и стали прототипами современных сорбционных технологий, применяемых для очистки крови. В их основе лежит взаимодействие компонентов крови с лигандом, иммобилизованным на нерастворимую, инертную, биосовместимую матрицу. Лиганд обладает специфичностью в отношении одного или нескольких компонентов крови и обеспечивает

Список литературы

Цена, в рублях: (при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)	1425

Скачать бесплатно	23423.doc

Найти готовую работу

ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:

Связаться

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ

15.04.24 Задачи, условия и этапы организации экспериментальной работы

15.04.24 Критерии качества преподавания

15.04.24 Категория нормы в обучающей деятельности

Архив материала для курсовых и дипломных работ

Ссылки:

Счетчики:

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.