Бесплатно скачать, заказать диплом, курсовую, диссертацию Изучение стабильности экспрессии чужеродный генов у трансгеннык растений таБака (Nicotiana tabacum L. )

У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ

Сделать закладку на сайт

Заказать диплом, курсовую, диссертацию

Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Книга жалоб
и предложений

Название	Изучение стабильности экспрессии чужеродный генов у трансгеннык растений таБака (Nicotiana tabacum L. )

Количество страниц	150

ВУЗ	МГИУ

Год сдачи	2010

Бесплатно Скачать	24251.doc

Содержание	Содержание ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...5 ВВЕДЕНИЕ...6 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...14 1.1 Получение трансгенных растений: общие сведения...14 1.2 Наследование чужеродных генов и вариабельность их экспрессии у трансгенных растений...20 1.3 Инактивация чужеродных генов в растительном геноме...24 1.4 Молекулярно-генетические механизмы инактивации чужеродной ДНК в ядерном геноме трансгенных растений...32 1.4.1 Структура и местоположение экзогенной ДНК в растительном геноме...32 1.4.2 Замолкание экспрессии трансгена и модификация ДНК...34 1.4.3 Мутации растительных генов, влияющих на процесс инактивации экспрессии чужеродной ДНК...40 1.5 Примеры инактивации экспрессии множественных копий собственных • растительных генов...50 1.6 Инактивация экспрессии множественных копий генов у грибов-аскомицетов...52 1.7 Использование феномена инактивации экспрессии множественных копий генов для целенаправленного выключения экспрессии растительных генов...54 1.8 Стратегия предотвращения инактивации целевых генов в трансформированных растениях...56 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...62 ф. 2.1 Получение трансгенных растений табака...62 2.2 Типы генетических конструкций...63 2.3 Гибридологический анализ трансгенных растений табака...65 3 2.4 Определение активности неомицинфосфотрансферазы II in situ...67 2.5 Флуориметрическое определение активности р-глюкуронидазы в листьях трансгенных растений табака...68 2.6 Выделение геномной ДНК из листьев табака...69 2.7 Саузерн блот гибридизация геномной ДНК трансгенных растений табака...70 2.8 Выделение РНК из растительной ткани и точечный Нозерн блоттинг...70 2.9 Подтверждение наличия дупликаций в области инсерции Т-ДНК с помощью метода ПЦР...71 2.10 Проверка исходных трансформантов на присутствие в растительном геноме векторных последовательностей с помощью метода ПЦР...72 2.11 Элекгрофоретический анализ ДНК...73 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...74 3.1 Стабильность экспрессии маркерного гена nptll у гибридов от скрещивания трансгенных растений табака с одной инсерцией Т-ДНК...74 3.2 Анализ стабильности наследования гена nptll у трансгенных растений табака со множественными инсерциями Т-ДНК...81 3.3 Моделирование влияния дупликации в структуре Т-ДНК на стабильность экспрессии маркерных генов nptll и uidA в трансгенных растениях табака...87 3.3.1 Сравнительный анализ стабильности экспрессии гена nptll в первом и втором поколениях от самоопыления трансгенных растений табака (с одной копией гена uidA и с дупликациями данного гена в составе Т-области)...87 3.3.2 Анализ активности ферментов (5-глюкуронидазы и NPTII в двух группах трансгенных растений табака (с одной копией гена uidA и прямой дупликацией данного гена)...92 3.3.3 Анализ стабильности экспрессии гена nptll у гибридов Fi от различных типов скрещиваний...98 4 3.3.4 Встраивание векторных последовательностей в растительный геном исходных трансгенных растений табака...ПО 3.4 Мозаичный характер проявления экспрессии гена nptll в трансгенных растениях табака модельной линии Nu 21...113 ЗАКЛЮЧЕНИЕ...144 ВЫВОДЫ...148 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...150 Введение СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ nptll- ген неомицинфосфотрансферазы II E.coli uidA - ген р*-глюкуронидазы E.coli БАП - К6-бензиламинопурин НУК - нафтилуксусная кислота Кт+ - канамицин-устойчивые растения Km" - канамицин-неустоичивые растения ПЦР - полимеразная цепная реакция ВМЦК- вирус мозаики цветной капусты ЦТАБ - цетилтриметиламмония бромид EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота SDS - додецилсульфат натрия БСА - бычий сывороточный альбумин Трис-HCI - трис (гидроксиметил) аминометан ТЭ - транспозонный элемент т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов 6 ВВЕДЕНИЕ За последнее десятилетие в ведущих биотехнологических центрах мира интенсивно ведутся работы по модификации ядерного генома высших растений с применением методов генной инженерии. При создании трансгенных растений и их внедрении в сельское хозяйство как коммерческих культур наиболее важным моментом является достижение высокого и стабильного уровня экспрессии перенесенных целевых генов как среди исходных трансформантов и их потомков от самоопыления, так и у гибридов от их скрещивания. Исследования стабильности экспрессии и наследования чужеродной ДНК в геноме трансгенных растений показали, что, как правило, они наследуются по классическим законам Менделя как доминантные мутации (Potrykus et al, 1985; Budar et al, 1986). Однако уже через несколько лет после получения первых трансформантов исследователи столкнулись с явлением вариабельности экспрессии чужеродных генов и феноменом неменделевского наследования, связанного с потерей экспрессии ("замолканием") трансгенов (Potrykus et al, 1985; Budar et al, 1986; Deroles, Gardner, 1988). С начала 1990-х годов и до настоящего времени продолжается активное исследование феномена инактивации и изменений в экспрессии перенесенных генов у генетически модифицированных растений (Matzke et al, 1989, 2000, 2004; Mittelsten Scheid et al, 1991; Vance, Vaucheret, 2001). Частота инактивации гетерологичных генов в первом поколении от самоопыления исходных трансформантов, полученных с помощью агробактериальной трансформации, может составлять немногим более половины случаев по данным разных исследований (И dar et al, 1986; Deroles, Gardner, 1988; Meza et al, 2001; Sallaud et al, 2001V В данную группу в основном входят трансформанты с множественны \ инсерциями чужеродной ДНК, интегрированными в один или несколько районов растительного генома. Однако известны случаи потери экспрессии тршк.с в в последующих поколениях при самоопылении моноинсерционных растений (Cherdshewasart et al, 1993; Metz et al, 1997; Дейнеко и др., 1998; McCabe et al, 1999; Fu et al, 2000; Vain et al, 2002; Sallaud et al, 2003) и у гибридов от их скрещиваний (Cherdshewasart et al, 1993; Schmulling, Rohrig, 1995; Charrier et al, 2000). Частота инактивации может существенно возрастать, если в состав генетической конструкции включены тандемные копии генов, как в прямой, так и в обратной ориентации (Wang, Waterhouse, 2000; Ma, Mitra, 2002). Непредсказуемые изменения в стабильности экспрессии трансгенов как среди потомков от самоопыления, так и у гибридов от скрещиваний трансгенных растений, нежелательны с коммерческой точки зрения и такие трансформанты необходимо выбраковывать в дальнейшей селекционной работе. Однако трансгенные растения с нестабильным уровнем экспрессии чужеродных генов представляют несомненный интерес в качестве моделей для исследования причин и механизмов инактивации экспрессии рекомбинантных генов, что вносит существенный вклад в понимание молекулярно-генетических механизмов регуляции экспрессии растительных генов (Fagard, Vaucheret, 2000; Matzke et ah, 2000) и способов защиты растительного генома от амплификации транспозонных элементов, вирусов и вироидов (Vance, Vaucheret, 2001). Актуальность проблемы. Бурное развитие генетической инженерии и биотехнологии, разработка методов переноса генетического материала в растительную клетку позволило модифицировать геном многих видов растений. Трансгенные растения представляют собой яркий пример преодоления физических, эволюционных и генетических барьеров, которые изолируют геномы различных организмов (Miki, McHugh, 2004). К настоящему времени накоплены экспериментальные данные о нестабильности экспрессии чужеродной генетической информации в растительном геноме, связанные, главным образом, с инактивацией и изменениями в экспрессии гетерологичных генов (Flavel, 1994; Matzke, Matzke, 1995; Matzke et ah, 2000). На трансгенных растениях табака, риса и Arabidopsis thaliana получены модельные линии, позволяющие изучать данный феномен (Kilby et ah, 1992; Matzke et ah, 1994a; Voucheret et al., 1994; Davies et ah, 1997; Mittelsten Sheid et ah, 1998; Fu et ah, 2000). Матзцке с соавт. на трансгенном табаке исследовали свойства и структуру трансгенного Н локуса, который включает серию аллелей. Аллели со сложной структурой Т-ДНК (с дупликациями, векторными последовательностями) способны вызывать процесс транс-инактивации других чужеродных генов под управлением NOS промотора нопалинсинтазы A. tumeficeins в геноме гибридов (Matzke et ah, 1989, 1994а; Jakowitsch et ah, 1999). Достаточно 8 хорошо исследован мультикопийный локус 271, способный вызывать замолкание экспрессии трансгенов, находящихся под управлением 35S промотора ВМЦК у трансгенных растений табака (Vaucheret et al, 1994; Park et al, 1996). Именно на трансгенных растениях петунии и томата в 1990 году впервые был описан феномен ко-супрессии — координированного подавления экспрессии трансгенов и гомологичных им хозяйских генов, связанного с посттранскрипционным разрушением мРНК в цитоплазме (Napoli et al, 1990; Van der Krol et al, 1990; Smith et al, 1990). Данное явление в настоящее время обнаружено у нематоды Caenorhabditis elegans (Fire et al, 1998), Drosophila melanogaster (Misquitta et al, 1999; Pal-Bhadra et al, 2002), Trypanosome brucei (Ngo et al, 1998), Paramecium (Ruiz et al, 1998), млекопитающих (Wianny et al, 2000) и получило название РНК интерференция. На основе феномена инактивации экспрессии трансгенов разработаны рекомендации для создания различных генетических конструкций, как обеспечивающих достаточно высокий уровень экспрессии гетерологичного белка в трансформантах, так и целенаправленно вызывающих инактивацию экспрессии определенных растительных генов (Wesley et al., 2001; Gossele et al, 2002; Stoutjesdijk et al., 2002; Brummel et al., 2003). Сходный феномен инактивации множественных копий генов в ядерном геноме в настоящее время активно исследуется у низших грибов Neurospora crassa (Selker, 1997), Ascobolus immerses (Rhounim et al, 1992), Coprinus cinereus (Freedman, Pukkila, 1993), Magnoporte grisea (Ikeda et al, 2002) и Podospora anserine (Graia et al, 2001). Показано, что интеграция множественных тандемных копий гена white в геном Drosophila melanogaster приводила к нарушению стабильности экспрессии трансгена, что проявлялось либо как мозаицизм, либо как отсутствие ожидаемого фенотипа (Dorer, Henikoff, 1997). Авторами была установлена отрицательная корреляция между числом встроенных копий трансгена и стабильностью его экспрессии. Взаимосвязь между числом копий гена и уровнем его экспрессии обнаружена и для ряда собственных растительных генов (Todd, Vodkin, 1996; Luff et al, 1999). Так ген pail-pai4 A. thaliana линии Wassilewskija, организованный в виде инвертированного повтора, подавляет экспрессию трех гомологичных однокопийных генов pail, pai2, pai3 линии Colombia при объединении их в геноме гибридов (Luff et al, 1999). Таким образом, в связи с интенсивным развитием генетической инженерии и биотехнологии растений проблема инактивации экспрессии чужеродных генов в трансгенных растениях представляется весьма актуальной. Важность данных исследований очевидна, так как усилия многих исследователей по реконструкции генома растений могут не привести к желаемым результатам. Исследования феномена инактивации экспрессии чужеродных генов в геноме трансгенных растений вносят существенный вклад и в решение фундаментальных задач - выявлены новые механизмы регуляции экспрессии растительных генов и устойчивости к вирусам, ТЭ, основанные на гомологии нуклеотидной последовательности (Fagard, Vaucheret, 2001; Vance, Vaucheret, 2001; Matzke, Matzke, 2004). Однако, несмотря на очевидный прогресс данного научного направления, остается еще много неясных вопросов. Поэтому изучение стабильности экспрессии чужеродных генов у трансформантов и их потомков, у гибридов от различных видов скрещиваний, получение новых модельных систем на трансгенных растениях представляется чрезвычайно актуальным. Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение стабильности экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) в поколениях от самоопыления и гибридах от различных типов скрещиваний. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: 1. Провести гибридологический анализ стабильности экспрессии маркерного гена nptll у трансгенных растений табака с одной инсерцией Т-ДНК в ядерном геноме. 2. Проанализировать стабильность наследования гена nptll у трансгенных растений табака с множественными событиями интеграции Т-ДНК. 3. Выделить модельные линии трансгенных растений табака, содержащих в составе области Т-ДНК прямые или инвертированные повторы гена uidA, с нестабильным характером экспрессии маркерных генов. 4. Провести гибридологический анализ наследования мозаичного характера проявления экспрессии гена nptll в трансгенных растениях табака модельной линии Nu 21. 10 Научная новизна и практическая ценность. Для изучения наследования и стабильности экспрессии чужеродных генов были выделены модельные линии трансгенных растений табака: 1) трансгенные растения с одиночными и множественными вставками Т-ДНК; 2) трансформанты, имеющие в геноме Т-ДНК инсерцию с дупликацией гена uidA и одной копией гена прШ; 3) трансгенное растение табака Nu 21 с мозаичным характером проявления экспрессии маркерного гена nptIL В исследовании представлены различные варианты организации инсерции Т-ДНК, при этом, использование маркерных генов позволило на больших выборках проследить особенности их наследования в поколениях и гибридах трансгенных растений. Проведен гибридологический анализ характера наследования маркерного гена прШ в поколениях от самоопыления исходных трансформантов, а так же гибридов от различных видов скрещиваний. Установлено, что частота инактивации гомологичных трансгенов существенно возрастает в геноме гибридных растений. Впервые показано, что наличие дупликации гена uidA в составе Т-ДНК инсерции оказывает существенное влияние на стабильность экспрессии рядом расположенного другого маркерного гена прШ, при этом инактивированное состояние по гену uidA влияло на стабильность экспрессии гена прШ преимущественно в гемизиготе. Впервые проведен гибридологический анализ наследования мозаичного характера экспрессии маркерного гена прШу потомков (Тг Т4) и гибридов от скрещиваний с диким типом трансгенных растений табака. Отобраны гибридные комбинации и потомки от самоопыления, представляющие несомненный интерес для дальнейшего более детального изучения молекулярно-генетических механизмов инактивации экспрессии трансгенов. Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на следующих конференциях, симпозиумах и конгрессах: международной конференции, посвященной памяти академика А.А. Баева. Москва, 20-22 мая 1996 г.; German-Russian Cooperation in Biotechnology. Workshop IV. Russia. St.-Peterburg, October 10-13, 1996 г.; международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». Москва, 1997 г.; международной конференции «Новые направления биотехнологии». Москва, 27-29 апреля 1998 г.; International Congress «Plant Biotechnology and in vitro biology in the 21st century». Jerusalem, Israel, June 14-19, 1998 г.; всероссийском симпозиуме "Изучение генома и 11 генетическая трансформация растений". Иркутск, 23-27 августа 1999 г.; II съезде Всесоюзного Общества Генетиков и Селекционеров (ВОГИС). Санкт-Петербург, 1-5 февраля 2000 г.; конференции молодых ученых, посвященной 100-летию со дня рождения М.А. Лаврентьева. Новосибирск, 4-6 декабря 2000 г.; международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология», Москва (18-21 ноября) - Минск (22-24 ноября), 2001 г.; 1-м международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития». Москва, 14-18 октября 2002 г.; 8-й международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Саратов, 9-13 сентября 2003 г.); III съезде ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». Москва, 6-12 июня 2004 г.; международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология». Минск, 24-26 ноября 2004 г.. Материалы диссертационной работы представлялись в устных докладах на отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН в 2001, 2004 гг.. Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статей. Deineko E., Zagorskaya A., Filipenko E., Filipenko M., Novoselya Т., Kochetov A., Komarova M., Shumnyi V. Instability of nptll gene expression in the progeny of transgenic tobacco plants {Nicotiana tabacum L. and N. plumbaginifolia L.) // Biotechnology and biotechnological equipment. 1996. N. 4. P. 89-92. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская А.А., Филипенко Е.А., Шумный В.К. Стабильность экспрессии гена nptll в популяции трансгенных растений табака // ДАН. 1999. Т. 369. С. 420-423. Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Стабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) с множественными инсерциями Т-ДНК // Генетика. 2000. Т. 36. " -'27-430. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская . ,.. Филипенко Е.А., Шумный В.К. Нестабильность экспрессии чужеродных ген трансгенных растений табака // Физиология растений. 2000. Т. 47. №. 3. С. 394 Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская ... Филипенко Е.А., ПухначеваН.В., Шумный В.К. Инактивирование чужеродных генов в геноме трансгенных растений // Изучение генома и генетическая трансформация растений. Новосибирск: Наука, 2001. С 132-142. 12 Novoselia T.V., Deineko E.V., Filipenko E.A., Shumnyi V.K. Expression stability of marker gene nptll in transgenic plants Nicotiana tobacum L. with single T-DNA insertion // Biotechnology and biotechnological equipment. 2001. V.15. N.2. P. 3-7. Новосел я Т.В., Дейнеко Е.В. Моделирование нестабильной экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2002. Т. 49. № 3. С. 437-443. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (276 наименований). Работа изложена на 172 страницах, включает 29 рисунков и 26 таблиц в тексте диссертационной работы. Благодарности. В разные периоды работа была поддержана отечественными грантами: РФФИ (№96-04-51075) «Наследование и стабильность экспрессии чужеродных генов в геноме трансгенных растений: молекулярно-генетический анализ гена nptll у трансгенных растений табака» (исполнитель); РФФИ (№97-04-48763) «Инактивирование чужеродных генов в геноме трансгенных растений: молекулярно-генетические механизмы» (исполнитель); РФФИ (№97-04-49334) «Нестабильность экспрессии чужеродных генов в поколениях трансгенных растений: исследование роли дупликаций в структуре Г-ДНК» (исполнитель); РФФИ (№00-04-49557) «Молекулярно-генетические механизмы функционирования чужеродных генов в геноме трансгенных растений» (исполнитель); грантом для научных проектов молодых ученых СО РАН, посвященном 100-летию со дня рождения академика М.А. Лаврентьева, 2000-2001 г. (руководитель и исполнитель); РФФИ (00-15-97968) -«Особенности преобразования геномов и функционирование генов в процессе хромосомной и генной инженерии растений» (исполнитель); госконтракт 43.050. 11.1537 от 05.02.2002 г. «Молекулярно-биологический анализ генетических факторов, влияющих на "замолкание" целевого гена в ряду поколений трансгенных растений табака» (исполнитель); № 25.8 программы РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека» (направление: «Фундаментальные проблемы трансгенеза растений и животных») (исполнитель). Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному руководителю д.б.н. Е.В. Дейнеко, сотрудникам лаборатории гетерозиса растений ИЦиГ СО РАН Е.А. Филипенко, А.А. Загорской, Ю.В. Сидорчуку и Н.В. Пухначевой, 13 сотрудникам сектора генетической инженерии растений ИЦиГ СО РАН к.б.н. А.В. Кочетову, к.б.н. М.Л. Комаровой, Е.А. Трифоновой и А.В. Романовой; а так же сотруднику лаборатории фармакогеномики ИХБиФМ СО РАН к.б.н. М.Л. Филипенко, участвовавших в выполнении ряда экспериментов и в обсуждении полученных данных, нашедших отражение в совместных публикациях. 14 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Получение трансгенных растений: общие сведения Технологии получения трансгенных растений основаны на переносе в растительный геном рекомбинантных генов из разных гетерологичных систем (вирусов, микроорганизмов, млекопитающих и др.)- Предложены два основных способа переноса чужеродной генетической информации: 1) трансформация с помощью почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens (Zambryski et al, 1983; Zupan et al, 2000); 2) прямой перенос генетических конструкций с использованием таких методов, как бомбардировка протопластов микрочастицами с нанесенными на них векторными ДНК (Christou, 1992), использование липосом (Deshayes et al, 1985), микроинъекции в клетки растений (Crossway et al, 1986), электропорация протопластов (Fromm et al, 1985) и др. Выбор способа трансформации растений зависит от многих факторов: разработки методов культивирования и регенерации in vitro для данного вида растения, от чувствительности к почвенным бактериям и возможностей экспериментатора. Рассмотрим процесс переноса и интеграции Т-ДНК при агробактериальной трансформации с точки зрения тех событий, которые могут влиять на экспрессию перенесенных генов. Перенос и встраивание Т-ДНК в растительный геном при агробактериальной трансформации. Представители рода Agrobacterium содержат уникальный природный вектор для горизонтального переноса бактериальных генов в геном высших растений, обозначенного термином «генетическая колонизация». Роль данного вектора выполняет Ti (tumor inducing) плазмида, имеющая в своем составе несколько районов: vir (virulence) область, кодирующая 6 генов вирулентности (virA, virB, virC, virD, virE, virG), Т-область (transferred DNA, Т-ДНК), ограниченная небольшими прямыми повторами 25 п.н., Tra-область с генами коньюгативного переноса и OriV - область репликации плазмиды. В природных штаммах область Т-ДНК включает гены синтеза опинов и белков (онкогенов), участвующих в биосинтезе растительных гормонов; экспрессия этих генов вызывает неконтролируемую пролиферацию растительных клеток (Чумаков, 2001; Zhu et al, 2000). Установлено, что перенос Т-ДНК в растительную клетку определяется только фланкирующими 15 правым и левым повторами, поэтому гены заключенные в этой области заменяются другими, представляющими интерес для исследователя (целевыми и маркерными). Процесс переноса Т-области условно может быть разделен на два этапа: первый - бактериальный, связанный с образованием одноцепочечной Т-ДНК и второй -растительный, включающий непосредственно процесс переноса гетерологичных генов в цитоплазму и ядро растительной клетки, а так же встраивание их в геном. На первом этапе активация генов vir области фенольными соединениями, выделяющимися при повреждении клеточной стенки растительных клеток, запускает процессинг Т-ДНК по типу коньюгативного бактериального переноса, в результате которого образуются одноцепочечные молекулы ДНК (Tinland, 1996; Zupan et ah, 2000). Механизм переноса Т-области из бактерии в растительную клетку еще недостаточно исследован, предполагают, что в образовании мембранного канала участвуют как бактериальные белки, так и белки растительного происхождения (Tinland, 1996; Dumas et al, 2001). В цитоплазму растительных клеток Т-ДНК попадает в виде одноцепочечной молекулы, защищенной от действия экзонуклеаз белком virE и с ковалентно прикрепленным на 5' конце белком virD2 (Citovsky et ah, 1989; Tinland et ah, 1994; Rossi et ah, 1996; Tinland, 1996). Механизм проникновения данного нуклеопротеинового комплекса в ядро реципиентной растительной клетки так же мало изучен, известно, что оба белка virE и virD2 содержат сигнальные последовательности ядерной локализации белка (NLS) (Citovsky et ah, 1992; Howard etah, 1992). Встраивание чужеродных генов в растительный геном происходит в большинстве случаев по механизму негомологичной рекомбинации, при котором необходим лишь небольшой участок гомологии порядка 6-7 п.н. между растительной ДНК и краевыми последовательностями переносимых векторов (Gheysen et ah, 1991; Mayerhofer et ah, 1991). Известно, что данный процесс является многоступенчатым и в нем принимают участие как бактериальные белки virE и virD2, так и растительные ферменты, отвечающие за репликацию и репарацию ДНК (Tinland, 1996; Salomon, Puchta, 1998; Ziemienowicz et ah, 2000; Chilton, Que, 2003; Gelvin, 2003). На этапе интеграции могут происходить ошибки, ведущие к встраиванию усеченных фрагментов Т-ДНК (Nacry et ah, 1998; Jakowitsch et ah, 1999), образованию конкатамеров множественных тесно сцепленных копий гетерологичных генов 16 (Pawlowski et al, 1998; Jakowitsch et al, 1999; Kohli et al, 1999) и перестроек в растительной ДНК на правой или/и левой границах Т-ДНК в виде делеций различной протяженности, прямых и инвертированных дупликаций (Kumar, Fladung, 2001a; Svitashev et al, 2002; Forsbach et al, 2003; Windels et al, 2003). В ядерный геном растительных клеток могут встраиваться от одной до нескольких копий Т-ДНК. На основании результатов анализа популяций исходных трансгенных растений установлено, что примерно в 40-60% выявляются растения с одной вставкой трансгена, в остальных случаях - с множественными Т-ДНК инсерциями (Budar et al, 1986; Deroles, Gardner, 1988; Herberle-Bors et al, 1988; Van der Hoeven et al, 1994; Sallaud et al, 2003). Известно, что встраивание множественных тесно сцепленных копий гетерологичных генов часто наблюдается при прямом переносе генов в растительную клетку (Pawlowski et al, 1998; Kohli et al, 1999; Vain et al, 2002). Довольно высокий процент растений с тандемными повторами в одном локусе регистрируется и при агробактериальной трансформации (Jones et al, 1987; Jorgensen et al, 1987; Kumar, Fladung, 2001a). Наличие множественных копий в составе чужеродной инсерции может оказывать влияние на уровень и стабильность экспрессии перенесенных генов. Отмечена отрицательная корреляция между уровнем экспрессии трансгенов и числом их копий в геноме (Hobbs et al, 1990; Assaad et al, 1993; Jakowitsch et al, 1999; Wang et al, 2000; Ma et al, 2002). Образование тандемных последовательностей перенесенных генов в растительном геноме возможно в следующих случаях: 1) при репликации Т-области; 2) при лигировании Т-ДНК; 3) при одновременном встраивании нескольких цепей Т-ДНК. Данные предположения основаны на результатах анализа механизмов встраивания фрагментов экзогенной ДНК в растительный геном и данных о нуклеотидных последовательностях районов стыков растительной ДНК и Т-ДНК, а так же участков между Т-ДНК в сложно организованных локусах. Согласно первой модели, до или в процессе интеграции в реципиентный геном одноцепочечной цепи Т-ДНК может происходить репликация Т-области с последующим встраиванием тандемных копий трансгенов (Jorgensen et al, 1987). Следующая гипотеза объясняет образование дупликаций трансгенов лигированием отдельных Т-ДНК до или в момент интеграции в растительный геном (De Neve et al, 1997; De Buck et al, 1999). В пользу данной гипотезы свидетельствуют следующие 17 экспериментальные данные: при трансформации растений табака и Arabidopsis thaliana двумя линиями агробактерий, несущими различные маркерные гены в составе Т-области, показано, что отдельные Т-ДНК часто встраиваются совместно в один локус ядерного генома. Так из 27 исходных трансформантов A. thaliana у 12 растений наблюдалось сцепленное наследование трансгенов из двух независимых Т-ДНК, организованных в виде инвертированных или прямых дупликаций (De Neve et al, 1997). Согласно третьей модели существует также возможность одновременного независимого встраивания множественных Т-ДНК в один район растительного генома (Kumar, Fladung, 2000 а). Трансгенные растения с множественными копиями чужеродной ДНК в одном локусе растительного генома можно получить целенаправленно, вводя в генетическую конструкцию повторенные последовательности генов (Assaad et al, 1993; Conceizro et al, 1994; Wang et al, 2000; Ma et al, 2002) или трансформируя растение несколькими генетическими конструкциями, расположенными на разных плазмидах (Maqbool, Christou, 1999). Возникновение дупликаций и перестроек трансгенов в структуре инсерции выявляется с помощью молекулярных методов: рестрикционным анализом с последующей Саузерн-блот гибридизацией (Дрейпер и др., 1991; Bhat, Srinivasan, 2002), полимеразной цепной реакцией (Kumar, Fladung, 2000 б), клонированием и секвенированием области Т-ДНК (Gheysen et al, 1991; Morino et al, 1999; Svitashev et al, 2002). Известно, что тандемные повторы могут быть ориентированны "голова к хвосту" — прямые дупликации и "голова к голове", "хвост к хвосту" — инвертированные дупликации. При этом в одной и той же инсерции могут встречаться различные комбинации дупликаций, включая тандемные повторы неполных копий генов (Jakowitsch et al, 1999). Например, описано растение Arabodopsis thaliana с двумя инсерциями Т-ДНК, одна из которых представлена инвертированным тандемным повтором, а другая — только небольшим участком из левой области Т-ДНК (Nacry et al, 1998). Статистический анализ частоты инсерции Т-ДНК в различные хромосомы растительного генома A. thaliana указывает на случайный характер встраивания рекомбинантных генов (Szabados et al, 2002; Forsbach et al, 2003). Однако есть указания на преимущественное встраивание в транскрипционно активные районы

Список литературы

Цена, в рублях: (при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)	1425

Скачать бесплатно	24251.doc

Найти готовую работу

ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:

Связаться

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ

15.04.24 Задачи, условия и этапы организации экспериментальной работы

15.04.24 Критерии качества преподавания

15.04.24 Категория нормы в обучающей деятельности

Архив материала для курсовых и дипломных работ

Ссылки:

Счетчики:

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.