Бесплатно скачать, заказать диплом, курсовую, диссертацию Экспериментальное исследование клеточный механизмов кроветворения в онтогенезе

У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ

Сделать закладку на сайт

Заказать диплом, курсовую, диссертацию

Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Книга жалоб
и предложений

Название	Экспериментальное исследование клеточный механизмов кроветворения в онтогенезе

Количество страниц	207

ВУЗ	МГИУ

Год сдачи	2010

Бесплатно Скачать	25242.doc

Содержание	Содержание ОГЛАВЛЕНИЕ ei Список сокращений...5 ВВЕДЕНИЕ...7 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...16 1. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ...16 2. ПОЛУЧЕНИЕ ЗАРОДЫШЕЙ МЫШЕЙ...16 3. РЕНТГЕНОВСКОЕ ОБЛУЧЕНИЕ...16 4. ГАММА-ОБЛУЧЕНИЕ...16 5. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КРОВЕТВОРНОЙ ТКАНИ И КРОВЕТВОРНЫЕ КОЛОНИИ В СЕЛЕЗЕНКЕ...16 6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ САМООБНОВЛЕНИЯ КОЕ-С...16 7. Н3-ТИМИДИНОВОЕ И Н3-УРИДИНОВОЕ «САМОУБИЙСТВО»...17 8. ОКСИМОЧЕВИНОВОЕ «САМОУБИЙСТВО»...17 9. ОБРАБОТКА АНТИБИОТИКАМИ...18 10. ОБРАБОТКА 5-ФТОРУРАЦИЛОМ (5-ФУ)...18 11. ОБРАБОТКА ДИПИНОМ...18 12. АНЕМИЯ...18 13. ЭКТОПИЧЕСКАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ...18 14. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА...19 15. ПОЛУЧЕНИЕ КРОЛИЧЬЕЙ АНТИСЫВОРОТКИ К ГОЛОВНОМУ МОЗГУ МЫШИ (КАСММ) И ЭКСПОЗИЦИЯ С НЕЙ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТОК...19 16. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ...20 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...21 1. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КРОВЕТВОРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК...22 * 2. ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ СТАТУС КРОВЕТВОРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК...29 2.1. Исследование кроветворных стволовых клеток с помощью мультипараметрического анализа...29 2.2. Содержание РНК...31 2.3. Фенотипические различия покоящихся и пролиферирующих КСК...32 2.4. Положение КСК в клеточном цикле и способность к репопуляции...33 2.5. Исследование пролиферативной активности КСК с помощью цитотоксических препаратов...34 2. 6. Сочетанный эффект цитотоксических препаратов и цитокинов...38 2.7. Кинетика клеточного цикла КСК...39 3. РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КЛЕТКИ, ОБРАЗУЮЩИЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КОЛОНИИ В СЕЛЕЗЕНКЕ (КОЕ-С)...42 3.1. Метод селезеночных колоний и его применение для исследования популяции родоначальник клеток...42 3.2. Фенотипическая характеристика КОЕ-С...43 3.3. Сравнительная характеристика КОЕ-С, образующих ранние и поздние селезеночные колонии...45 3.3.1. Экспрессия антигенов клеточной поверхности...46 3.3.2. Пролиферативный статус КОЕ-С и регуляция их пролиферации...47 3.3.3. Чувствительность к цитотоксическим агентам...49 3.4. Положение КОЕ-С в гистогенетическом ряду кроветворных клеток...51 4. КРОВЕТВОРНОЕ МИКРООКРУЖЕНИЕ И ГЕМОПОЭЗ...57 'щ 4.1. Характеристика кроветворного микроокружения и его регуляторной функции. .57 4.2. Мезенхимные (стромальные) стволовые клетки...60 4.2.1. Фенотипическая и функциональная характеристика мезенхимных (стромальных) стволовых клеток...60 4.2.2. КОЕ-Ф - стромальная стволовая клетка...61 4.2.3. Эктопическая трансплантация костного мозга в виде фрагмента...62 4.2.4. Гистогенетические отношения МСК и КСК...64 4.2.5. МСК и мезенхимные сосудистые гладкомышечные клетки (МСГК)...64 5. КРОВЕТВОРНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ В ПРЕНАТАЛЬНОМ РАЗВИТИИ...66 5.1. Происхождение КСК в эмбриональном развитии млекопитающих...66 5.2. Печень как основной кроветворный орган в пренатальном онтогенезе...73 5.2.1. Развитие кроветворения в печени...73 5.2.2. Кроветворное микроокружение эмбриональной печени и миграция кроветворных клеток в кроветворные органы в пренатальном развитии...75 5.2.3. Характеристика КСК из фетальной печени...80 РЕЗУЛЬТАТЫ 83 1. РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КЛЕТКИ (КОЕ-С) В ПРЕ - И ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ МЫШИ...83 1.1. Характеристика популяции КОЕ-С печени зародыша мыши...83 1.1.1. Гетерогенность селезеночных колоний, образуемых клоногенными кроветворными клетками эмбриональной печени...83 1.1.2. Морфологическое типирование колоний через 7 и 11 суток после трансплантации кроветворных клеток эмбриональной печени...88 1.1.3. Характеристика свойств различных категорий эмбриональных кроветворных клеток, образующих колонии в селезенке...88 1.2. Структура популяции клоногенных кроветворных клеток в пре - и постнатальном онтогенезе...103 1.2.1. КОЕ-С, образующие крупные селезеночные колонии...104 1.2.2. КОЕ-С-эп, ответственные за образование мелких селезеночных колоний. ..112 1.2.3. Сравнительная характеристика КОЕ-С из разных кроветворных источников и происхождение КОЕ-С в печени в постнатальном онтогенезе...112 1.3. Родоначальные кроветворные и стромальные клетки печени зародыша при эктопической трансплантации...113 1.3.1. Кроветворные клоногенные клетки (КОЕ-С) печени зародышей мыши при кратковременном культивировании in vivo...113 1.3.2. Дифференцировочные потенции мезенхимы печени зародышей мышей...118 2. ИССЛЕДОВАНИЕ СИНТЕЗА РНК В РОДОНАЧАЛЬНЫХ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТКАХ КОСТНОГО МОЗГА...123 2.1. Синтез РНК в популяции КОЕ-С костного мозга интактных животных...123 2.1.1. Пролиферативная активность КОЕ-С...121 2.1.2. Действие ингибиторов ДНК-зависимого синтеза РНК — антибиотиков сиби-ромицина и актиномицина Д на КОЕ-С...121 2.1.3. Действие радиотоксических доз ЗН- уридина на КОЕ-С...121 2.1.4. Синтез РНК в КОЕ-С на разных этапах выделения кроветворных клеток ех vivo...124 2.1.5. Колониеобразующая активность КОЕ-С после экспозиции с актиномицином Д в дозе 0,04 мкг/мл/г, блокирующей синтез рибосомальной РНК...124 2.1.6. Специфичность действия низких доз актиномицина Д...125 2.2. Синтез рРНК в родоначальных кроветворных клетках (КОЕ-С) при экспериментально вызванной анемии...132 3. АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ ЭТАПОВ КРОВЕТВОРНОГО И СТРОМАЛЬНОГО РЯДОВ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ С ПОМОЩЬЮ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ...138 3.1. Динамика содержание КОЕ-С в костном мозге и селезенке после однократного введения дипина...138 3.2. Повреждение клеток стромы 5-фторурацилом и дипином и регенерация кроветворной ткани...146 3 4. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА НА РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ...153 4.1. Содержание КОЕ-С в кроветворных органах половозрелых животных...151 4.2. Динамика возрастных изменений содержания КОЕ-С в кроветворных органах крыс, экспонированных на борту биоспутника в плодном периоде развития...152 5. ВЛИЯНИЕ НЕПРЕРЫВНОГО ГАММА- ОБЛУЧЕНИЯ В НИЗКИХ ДОЗАХ НА РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ (КОЕ-С) И СТРОМАЛЬНЫЕ (КОЕ-Ф) КЛЕТКИ...162 5.1. Содержание кроветворных родоначальных клеток (КОЕ-С) в костном мозге... 162 5.2. Содержание родоначальных стромальных клеток (КОЕ-Ф) в костном мозге...162 5.3. Величина эктопических трансплантатов...162 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...173 ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ...199 ВЫВОДЫ...204 ЛИТЕРАТУРА...207 Введение Список сокращений АЗП АГМ БОЕ-Э ВПП-К Г-КСФ ГМ-КСФ ГМП жм ил КАСММ КОЕ-Э КОЕ-С КОЕ-С-7 КОЕ-С-11 КОЕ-К КОЕ-ГЭММ - КОЕ-Ф КМО КСК МП МЕП МСК олп омп ом S-колонии — ФСК 5-ФУ агглютинин зародыша пшеницы область аорты, гонад и мезонефроса бурстобразующая единица эритроцитов колониеобразующие клетки с высоким пролиферативным потенциалом гранулоцитарный колониестимулирующий фактор гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор гранулоцитарный-моноцитарный предшественник желточный мешок интерлейкин кроличья антисыворотка против (головного) мозга мыши колониеобразующая единица эритроцитов колониеобразующая единица селезенки колониеобразующая единица селезенки, формирующая колонии на 7-е сутки колониеобразующая единица селезенки, формирующая колонии на 11-е сутки колониеобразующая единица в культуре (in vitro) колониеобразующая единица гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов, макрофагов колониеобразующая единица фибробластов кроветворное микроокружение кроветворная стволовая клетка мультипотентные предшественники мегакариоцитарно-эритроцитарный предшественник мезенхимная (стромальная) стволовая клетка общий лимфоидный предшественник общий миелоидный предшественник оксимочевина stem - колонии стволовых клеток фактор стволовых клеток 5-фторурацил LT-KCK NOD/SCID - PCNA Rh-123 SP ST-KCK VLA-4 VCAM-1 long-term-HSC, кроветворная стволовая клетка с длительным са-моподдержанием nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency mice, мыши с нетучным диабетом и тяжелым комбинированным иммунодефицитом proliferating cell nuclei antigene, ядерный антиген пролифери-рующих клеток родамин 123 side population, побочная популяция клеток short-term-HSC, кроветворная стволовая клетка с ограниченным самоподдержанием very late activation antigen-4, антиген очень поздней активации vascular cell adhesion molecule-1 — молекула адгезии васкуляр-ных клеток-1 0 t ВВЕДЕНИЕ i. ¦ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Проблема клеточной дифференцировки является крайне актуальной для современной биологии и медицины. Интерес к ней специалистов разнообразного профиля (молекулярных биологов, генетиков, цитологов, биологов развития, и т.п.) резко возрос в связи с последними успехами в изучении эмбриональных и тканеспецифи-ческих стволовых клеток и не в последнюю очередь связан с поиском методов клеточной терапии для восстановления поврежденных органов и тканей. Кроветворная ткань представляет собой уникальную и наиболее экспериментально продвинутую модель для изучения механизмов дифференцировки и регенерации. Для нее характерно многообразие клеточных форм, различающихся по степени зрелости и специфике обменных процессов, а также линий (ростков) дифференцировки (эритроидная, гра-нулоцитарная, моноцитарная, мегакариоцитарная, лимфоидная). Клеточную основу, обеспечивающую восстановление зрелых клеток крови и кроветворной ткани в целом после естественной гибели терминально дифференцированных клеток, в ходе патологических процессов или действия различных повреждающих агентов, составляют кроветворные ,— стволовые клетки (КСК). Основные их свойства — способность к самоподдержанию и по- липотентность. Благодаря самоподдержанию КСК, возникнув в эмбриогенезе, не исчезают из кроветворной ткани и служат источником пополнения зрелых клеток на протяжении жизни организма. Полипотентность, т.е. способность давать потомство клеток, дифференцирующихся по многим направлениям, обеспечивает многообразие форменных элементов крови. Другое отличительное свойство кроветворной ткани — способность менять место локализации. Перемещение кроветворной ткани происходит в эмбриональном развитии, когда циркулирующие клетки репопулируют (заселяют) закладки кроветворных органов, а также в экспериментальных условиях и патологии при формировании эктопических очагов гемопоэза. Непременным условием нормально протекающего кроветворения является взаимодействие кроветворных стволовых и родоначальных клеток с клетками стромы, составляющими основу так называемого кроветворного микроокружения (КМО) (Старостин, 1986). Распознавание и удержание кроветворных клеток, их миграция осуществляется клетками КМО при участии молекул клеточной адгезии. Клетки КМО обеспечивают не только пространственную организацию кроветворных органов, но, контактируя с крове- ^ творными клетками, выделяют и аккумулируют разнообразные факторы роста, регули- рующие процессы пролиферации и дифференцировку КСК. Исследования последнего десятилетия показали, что популяция КСК гетерогенна и , включает два подотдела (компартмента) клеток, различающихся по фенотипу (антиген- ным характеристикам), продолжительности жизни, способности к дифференцировке и степени самообновления (Morrison, Weissman, 1994; Randal, Weissman, 1998; Kondo et al., 2003). Первый компартмент составляют КСК с неопределенно длительным самоподдержанием; второй - КСК, самоподдерживающиеся не более З-б недель. Мультипотентные (родоначальные) клетки входят в компартмент, который следует в диффероне за стволовым, и не обладают экстенсивным самоподдержанием. Часть мультипотентных клеток (общие миелоидные предшественники) дифференцируются в эритроидном, мегакариоци-тарном и миелоидном направлениях, способны образовывать в селезенке облученного животного клоны кроветворных клеток (колонии), различимые визуально, и представляют собой так называемые колониеобразующие единицы селезенки - КОЕ-С, давшие название методу их количественного учета in vivo. Хотя КОЕ-С не идентичны КСК, метод селезеночных колоний, используется для анализа КСК и в настоящее время. Его модификация, предложенная японскими исследователями, позволила продемонстрировать, что истинные КСК также способны формировать визуально различимые кроветворные клоны-колонии в селезенке в более поздние сроки по сравнению с мультипотентными предшественниками [Щ (Liang et al., 1999; Ikehara, 2000; Yang et al., 2002). Таким образом, метод селезеночных ко- лоний остается адекватной моделью исследования клоногенных кроветворных клеток разной степени зрелости и в зависимости от срока наблюдения позволяет вести дифференцированный учет как родоначальных клеток, так и КСК. Принципиальная организация кроветворного дифферона, как последовательного ряда клеточных форм со специфическими для каждой потенциями к дифференцировке и размножению, не вызывает сомнений. Однако к началу нашего исследования бьши неясны некоторые вопросы организации компартмента родоначальных клеток, свойства отдельных их категорий, их цитофизиологические особенности, а также изменения, которые происходят в популяции КОЕ-С в индивидуальном развитии. Прижизненное наблюдение кроветворных клонов-колоний в селезенке, образованных костномозговыми КОЕ-С показало, что колониеобразование является динамическим процессом появления и исчезновения клонов, образуемых клоногенными клетками, различающимися по степени зрелости и времени формирования клона (Magli et al., 1982; Priestley, Wolf, 1985; Molineux et al., 1986; Wolf, Priestley, 1986). Было обнаружено, что у 10 половозрелых животных популяция КОЕ-С костного мозга гетерогенна, и в зависимости от срока регистрации колоний можно анализировать категории более «молодых» и более «старых» КОЕ-С (Magli et al., 1982). К началу нашего исследования немногочисленные 8 факты указывали на то, что эмбриональная кроветворная ткань отличается по содержанию клоногенных клеток от костного мозга взрослых животных (Micklem, 1972, Gaidul et al., 1984). Однако данные о составе популяции эмбриональных КОЕ-С были весьма скудны и касались, в основном, печени зародышей одного срока развития (Metcalf et al., 1983; Johnson, Nicola, 1984; Gaidul et al., 1986). Наиболее полный труд Меткалфа и Мура, посвященный эмбриональным аспектам кроветворения, был создан, когда КОЕ-С рассматривались как однородная популяция клеток (Metcalf, Moore, 1971). Поэтому весьма актуальным представляется детальное исследование изменений в составе родоначальных кроветворных клеток в кроветворных органах в разные сроки пренатального онтогенеза, завершающиеся формированием дефинитивной кроветворной ткани. В постнатальном периоде, однако, в печени - органе, утратившим кроветворную функцию, Хрущовым с соавторами были описаны КОЕ-С и получены данные, что по некоторым характеристикам КОЕ-С печени половозрелых животных близки таковым из периферической крови (Хрущов и др., 1977; Старостин, 1986). Окончательный ответ на этот вопрос могло дать сравнительное исследование цитофизиологических характеристик индивидуальных КОЕ-С из различных кроветворных источников. Как известно, одним из важных показателей клеточной активности является интенсивность синтеза РНК, меняющаяся в зависимости от стадии дифференцировки клетки, потребностей в белковом синтезе, фазы митотического цикла и т.д. В норме КСК и КОЕ-С представляют собой покоящиеся популяции клеток (Hodgson, Bradley, 1979; van Zant, 1984; Lemer, Harrison, 1990; Berardi et al., 1995; Ross et al., 1982; Morrison et al., 1997). Предполагалось, что синтез РНК в митотически инертных КОЕ-С, находится на достаточно низком уровне и для вступления в пролиферацию необходима его активация. Однако эта цитофизиологическая особенность КОЕ-С оставалась практически не изученной, и ее исследование нуждалось в новых подходах, поскольку традиционная радиоавтография не может быть использована для анализа клоногенных кроветворных клеток, не имеющих характерных морфологических признаков в отличие от дифференцированных клеток таких, например, как малые лимфоциты. Костный мозг половозрелых животных является источником наряду с КСК и других стволовых клеток, в частности мезенхимных (стромальных), которые тестируются in vitro по образованию колоний фибробластоподобных клеток (КОЕ-Ф) и обладают, как и кроветворные клетки, определенной иерархической организацией (Owen, 1988). В прена-тальном и раннем постнатальном развитии стволовые клетки стромы выявлены в печени и селезенке, причем их численность, оцененная по числу формируемых ими колоний in vitro, соответствует гемопоэтической активности кроветворного органа (Van Den Heuvel et 9 al., 1987). Другой методический прием - эктопическая пересадка - позволяет вывить ме-зенхимные стволовые клетки функционально по их способности к дифференцировке в несколько типов стромальных клеток и формированию КМО, поддерживающего гемопоэз. Этот метод может быть с успехом использован для определения дифференцировочных потенций мезенхимных клеток, имеющихся в печени зародыша. В рамках общей проблемы стволовых клеток и их роли в восстановлении кроветворной ткани значительный интерес представляет исследование, помимо кроветворных, также и стволовых клеток стромы, которые также являются мишенью для различного рода повреждающих факторов. Проблема резистентности (или напротив) чувствительности к тому или иному повреждающему фактору и репаративных потенций кроветворной и соединительной тканей, в целом, не теряет своей актуальности и является основополагающей не только для экспериментальной биологии, но и практической медицины. Так, например, успех терапии злокачественных заболеваний крови определяется правильным выбором лекарственного препарата, введением его в чувствительной фазе клеточного цикла, учетом избирательности его действия на те или иные категории клеток. Знание цитофи-зиологических особенностей КСК, структуры их популяции, антигенных характеристик, пролиферативного статуса, времени обновления и т.д. позволяет выбрать стратегию при- менения тех или иных цитостатических веществ таким образом, чтобы сочетать максимальную чувствительность к препарату дефектных клеток с максимальной сохранностью стволовых элементов. Не менее остро проблема КСК стоит при трансплантации кроветворных клеток реципиенту с иммунодефицитом, разрушенной (поврежденной) облучением или токсическими агентами кроветворной тканью, поскольку положительный эффект трансплантации зависит от качества трансплантируемого материала, т.е. от присутствия в инокулуме достаточного числа клоногенных клеток, обладающих потенциями стволовых. Именно донорские КСК, репопулируя кроветворные органы, обеспечивают восстановление гемопоэза. Исследование дифференцировочных и пролиферативных потенций кроветворных и стромальных СК после действия тех или иных неблагоприятных факторов позволяет оценить полноту репаративной регенерации кроветворной ткани. Помимо практического применения цитотоксические препараты могут использоваться в качестве адекватного инструмента для изучения иерархической организации клеточных популяций. Экспериментальное удаление клеток определенной стадии дифферен-цировки позволяет не только определить их роль в восстановлении ткани, но и установить положение той или иной клеточной категории в диффероне. Учитывая специфику действия таких цитотоксических препаратов как 5-фторурацил и дипин, представляется весьма продуктивным использовать их для определения принадлежности исследуемых клеток к 10 той или иной стадии развития, их места в ряду кроветворной дифференцировки, а также участия в регенераторном процессе. Еще одной фундаментальной и практически значимой проблемой, связанной с функционированием кроветворной ткани, является адаптация организма к несвойственной ему среде обитания. Способность быстро отвечать на функциональные запросы, изменения окружающей среды, стрессовые и экстремальные воздействия позволяют считать кроветворную и соединительную ткани уникальными объектами и адекватными тест-системами и для изучения различных внешних воздействий. В частности, нормальное функционирование кроветворной системы является одним из непременных условий космических полетов. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют, что пребывание в космическом полете вызывает изменения в периферической крови у человека и млекопитающих (Berry, 1970; Газенко и др., 1974; Johnson et al., 1975; Leon et al., 1978, 1980; Илюхин, Бурковская 1981; Udden et al., 1995). Некоторые изменения, зарегистрированные в наиболее зрелом, периферическом, звене кроветворной системы могут быть вторичными и являться результатом более глубоких процессов, происходящих в кроветворной системе под влиянием факторов космического полета. Поэтому актуальность приобретают исследования других отделов кроветворного дифферона и, в первую очередь, от- делов стволовых и родоначальных клеток, обеспечивающих обновление кроветворной ткани и поддержание кроветворения на постоянном уровне. Модельные эксперименты на лабораторных животных дают уникальную возможность на обширном и однородном материале получить максимально полную картину изменений в кроветворной системе, связанных с действием факторов полета. В экспериментах на биоспутниках серии «Космос», выполненных нами совместно с учеными Чехословацкой академии наук, было оценено влияние космического полета на стволовые кроветворные клетки млекопитающих (крыс) и плодов, развитие которых частично проходило в условиях полета. Одним из наиболее значимых для кроветворной системы и постоянных космических факторов, помимо микрогравитации, является ионизирующее космическое излучение. Однако его влияние на кроветворную и соединительную ткани до настоящего времени остается практически не изученным. Следует подчеркнуть, что исследование подобного рода выходит за рамки космической программы и имеет медико-биологический, в том числе и экологический, аспект, поскольку у- облучение малой интенсивности является одним из компонентов радиоактивного природного фона, под воздействием которого живые организмы находятся в наземных условиях (Гусаров, Иванов, 2001; Кузин, 2002). Из сказанного следует, что для понимания закономерностей клеточной дифференцировки весьма актуально проведение многоплановых исследований кроветворной и со- 11 единительной тканей, включающих характеристику составляющих их клеточных популяций, детализацию дифферона в пре - и постнатальном развитии, участие отдельных суб-популяций в регенераторном ответе на разнообразные внешние воздействия. Результаты подобных исследований позволят дать более точную картину гистогенеза кроветворной и соединительной тканей. Цели и задачи исследования. Основной целью работы явилось исследование: - структурной (иерархической) организации некоторых этапов кроветворного и стромаль-ного дифферонов в индивидуальном развитии млекопитающих (мышей); - влияния воздействий различной химической и физической природы на родоначальные кроветворные и стромальные клетки. Конкретными задачами работы были следующие: 1. Исследование состава популяции родоначальных кроветворных клеток - КОЕ-С - и свойств отдельных их категорий на разных сроках пре - и постнатального развития. 2. Характеристика уровня синтеза РНК в популяции КОЕ-С. 3. Исследование чувствительности отдельных категорий КОЕ-С зародышей и взрослых животных к цитотоксическим препаратам (5-фторурацилу и дипину). 4. Исследование чувствительности родоначальных стромальных клеток (КОЕ-Ф) к дей-10 ствию цитотоксических препаратов (5-фторурацилу и дипину). 5. Характеристика потенций к дифференцировке мезенхимы печени в зависимости от уровня ее гемопоэтической активности. 6. Исследование влияния факторов космического полета на родоначальные кроветворные клетки в плодном периоде развития и постнатальном онтогенезе млекопитающих (крыс). 7. Изучение влияния непрерывного у- облучения в низких дозах на родоначальные кроветворные и стромальные клетки. Научная новизна исследования. В ходе работы получены новые данные об иерархической организации кроветворного дифферона в пре - и постнатальном онтогенезе, цитофи-зиологических особенностях родоначальных кроветворных и стромальных клеток, об участии отдельных их категорий в репаративном процессе и реакции на различные воздействия. 1. Впервые в кроветворной ткани зародышей мыши и особей раннего постнатального периода выявлены клоногенные клетки, отсутствующие в дефинитивной кроветвор-,0 ной ткани и образующие в селезенке мелкие колонии недифференцированных клеток в поздние после трансплантации сроки. Охарактеризованы свойства новой категории кло- ногенных клеток, названных по месту их обнаружения - эмбриональной печени - КОЕ-С- 12 эп. Показано, что КОЕ-С-эп находятся вне пролиферативного цикла, не самоподдерживаются, резистентны к 5-фторурацилу и кроличьей антисыворотке к головному мозгу мыши и на основании математического анализа их распределения могут быть причислены к стадии дифференцировки, предшествующей КОЕ-С — пре-КОЕ-С. 2. Получены данные об особенностях состава компартмента родоначальных клеток (КОЕ-С) в кроветворных органах (желточном мешке, печени, селезенке и костном мозге) на разных этапах онтогенеза. Они касаются соотношения разных типов клоногенных клеток (КОЕ-С-эп, КОЕ-С-7, КОЕ-С-11), пролиферативного статуса и т.д. и отражают функциональное состояние кроветворной системы, свойственное тому или иному этапу индивидуального развития особи. 3. Установлено, что КОЕ-С-11, присутствующие в печени в постнатальном онтогенезе, представляют собой более зрелые клетки по сравнению с КОЕ-С-11 из костного мозга половозрелых животных или печени зародышей, и идентичными КОЕ-С-11 из периферической крови. Таким образом, очевидно, КОЕ-С поступают в печень из циркуляции и не являются «дремлющими» эмбриональными. 4. Исследован синтез РНК в морфологически неидентифицируемых родоначальных клетках, как один из важнейших показателей их готовности к вступлению в митоз и коло- ниеобразованию. Установлено, что популяция КОЕ-С характеризуется интенсивным синтезом РНК и способностью к его быстрой активации, что свидетельствует о соответствия состояния пролиферативного покоя КОЕ-С Gi- периоду клеточного цикла. В стационарных условиях популяция КОЕ-С гетерогенна по содержанию рРНК и содержит клетки, как с относительно низким, так и высоким уровнем синтеза рРНК. Обнаружена стимуляция колониеобразования под влиянием актиномицина Д в дозах, подавляющих синтез рРНК. 5. Выявлено, что однократное введение алкилирующего препарата дипина вызывает длительное нарушение стационарного состояния кроветворной ткани, проявляющееся в периодических (синусоидальных) изменениях содержания кроветворных родоначальных клеток (КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11) в костном мозге и селезенке. Происходящие на протяжении жизни мыши периодические спады и подъемы численности КОЕ-С — транзиторной популяции клеток - дают основание заключить, что, во-первых, КСК, которые их генерируют, неоднородны по чувствительности к дипину, во-вторых, дифференцировка КСК осуществляется на основе клональной сукцессии 6. В популяции стромальных клеток костного мозга выделены категории клеток, различающихся по устойчивости к цитотоксическим препаратам (5-фторурацилу и дипину) и участию в регенерации эктопических трансплантатов. Наиболее чувствительные к 13 дипину и резистентные к 5-фторурацилу клетки обладают высокими репаративными потенциями и, очевидно, могут быть отнесены к стволовым клеткам стромы. 7. Впервые показано, что мезенхима печени зародышей в период активного кроветворения обладает широкими дифференцировочными потенциями. При трансплантации печени 14-суточных зародышей мыши под капсулу почки или в подкожную соединительную ткань половозрелых реципиентов происходит последовательное новообразование гиалинового хряща, кости и кроветворных очагов. 8. Впервые установлено снижение уровня миелопоэза у крыс после кратковременного космического полета, выражающееся в значительном сокращении численности кроветворных родоначальных клеток (КОЕ-С). Впервые также исследовано содержание КОЕ-С в кроветворных органах в пре- и раннем постнатальном развитии после экспозиции на борту биоспутника в плодном периоде. 9. Впервые обнаружен феномен стимулирующего действия непрерывного у- облучения в малых дозах (радиационный гормезис) на стромальные родоначальные клетки костного мозга, который выражается в активации пролиферации, увеличении численности популяции КОЕ-Ф и усиление регенераторных потенций стромальных родоначальных клеток. Теоретическая значимость работы. В данной работе проведено комплексное исследование родоначальных кроветворных и стромальных клеток, согласованная работа которых обеспечивает нормальное функционирование кроветворной ткани как единой системы. В кроветворном ряду дифференцировки обнаружена ранее неописанная в литературе категория клоногенных кроветворных клеток, являющаяся стадией дифференцировки, предшествующей КОЕ-С, и характерная для кроветворной ткани пренатального и раннего постнатального периодов развития. Получены экспериментальные данные, объективно свидетельствующие в пользу концепции функционирования КСК на основе кло-нальной сукцессии. В стромальном диффероне выявлены категории клеток, различающихся по регенераторным потенциям и чувствительности к цитотоксическим агентам. Предложена гипотетическая модель стромального ряда дифференцировки. Выявлено негативное воздействие факторов космического полета на миелопоэз, которое заключается в резком уменьшении численности родоначальных кроветворных клеток в кроветворных органах млекопитающих. Обнаружен феномен радиационного гормезиса, проявляющийся в увеличении про-лиферативной активности и численности родоначальных клеток стромы, а также усиление их способности к регенерации. Установление этого факта кардинально меняет сложившееся представление о радиации в сверхмалых дозах, как незначимом для кроветворной и 14 соединительной тканях воздействии, и диктует необходимость расширения исследований в данном направлении. Результаты углубляют и детализируют представления об организации стволового отдела, отдельных этапах дифференцировки кроветворных и стромальных клеток, цито-физиологических особенностях родоначальных кроветворных и стромальных клеток. Представленные в работе данные способствуют пониманию ведущей роли стволовых и родоначальных (мультипотентных) клеток в восстановительных процессах, связанных с действием разнообразных факторов. В практических целях кроветворную и стромальную ткани можно использовать как тест-системы для регистрации влияния разнообразных факторов внешней среды на организм животных и человека. Оценка резистентности клеточных популяций, входящих в их состав, позволяет определить репаративные возможности кроветворной и стромальной тканей, предвидеть и в перспективе предотвращать последствия неблагоприятных воздействий. Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих рабочих, Всесоюзных, Всероссийских и Международных конференциях, совещаниях и симпозиумах: 6-м Совещании европейской группы по изучению клеточной пролиферации (Москва, СССР, 1973), Республиканской конференции «Структурные и % функциональные изменения в клетках мезенхимы» (Киев, СССР, 1982), 5-м Ежегодном симпозиуме комиссии по гравитационной физиологии международного союза физиологических наук (Москва, СССР, 1983 г.), 17-м Совещании постоянно действующей рабочей группы соцстран по космической биологии и медицине программы «Интеркосмос» (Брно, Чехословакия, 1984 г.), 18-м Совещании постоянно действующей рабочей группы соцстран по космической биологии и медицине программы «Интеркосмос» (Гагра, СССР, 1985 г.), 7-м Всесоюзном совещании эмбриологов (Москва, СССР, 1986), Научной конференции «Методологические основы изучения и преподавания морфогенеза тканей и органов в адаптивных процессах» (Иркутск, СССР, 1987 г.), 1-й Республиканской научной конференции «Управление морфогенезом тканей и органов в процессе адаптации» (Иркутск, СССР, 1989 г.), Симпозиуме «Volga-Wilsede» (Москва, СССР, 1990), 33-м Международном конгрессе физиологических наук (Скт-Пб, Россия, 1997 г.), Международной конференции по регенерации (Кельн, Германия, 1997), Конференции «Клеточные и молекулярные аспекты регенерации и реконструкции тканей» (Москва, Россия, 1998 г.), 33-й Ассамблее COSPAR (Варшава, Польша, 2000), III Международном симпозиуме «Меха- Щ низмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002), 34-й Ассамблее COSPAR (Хьюстон, США, 2002), 1-м съезде Общества клеточной биологии (С.-Пт., Россия, 2003 г.), 35-й Ассамблее COSPAR (Париж, Франция, 2004). Апробация диссертации проведена на семина- 15 ре отдела цитологии и гистологии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 19 января 2004 года. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Объект исследования. В работе использованы 10-, 14- и 18-суточные зародыши, 2-х и 7-ми дневные мышата и половозрелые лабораторные мыши гибриды F1 (СВАхС57В1/6) самцы и самки, а также 18-суточные зародыши и половозрелые самцы и самки крыс линии Wistar. 2. Получение зародышей мышей. Скрещивали 3-месячных самок СВА с самцами С57В1/6. Срок зародышевого развития определяли, считая первым днем развития день обнаружения влагалищной пробки. Зародышей извлекали из матки, помещали в среду 199, освобождали от оболочек и под бинокулярной лупой извлекали кроветворные органы (желточный мешок, печень и селезенку). 3. Рентгеновское облучение. Сингенных мышей-реципиентов облучали на рентгеновской установке РУМ-17 (175 кВт, 15 мА, фильтры 1,0 А1 + 0,5 Си, мощность дозы - 53 Р/мин) в дозе 7,1 Гр. Дозу облучения контролировали с помощью клинического дозиметра 27012 (Германия). 4. Гамма-облучение. Животные-доноры костного мозга (10-15 жив) подвергались непрерывному 10-суточному гамма- излучению от радионуклида 60Со (энергия гамма- квантов 1,17 и 1,33 МэВ, среднесуточная поглощенная доза 0,15-0,2 сГр, суммарная доза 1,5-2 сГр). Часть доноров (10-15 жив) служила контролем и находилась в соседнем помещении, где радиационные условия соответствовали естественному радиационному фону. Радиационный фон в помещении при закрытом источнике гамма - облучения составлял 7,7 мкГр/сут. 5. Трансплантация кроветворной ткани и кроветворные колонии в селезенке. Содержание родоначальных кроветворных клеток определяли методом Тилла и МакКаллока (Till, McCulloch, 1961). Взвесь кроветворных клеток вводили внутривенно в дозе 0,5-2х 105 клеток мышам и 1 -2х 10 6 клеток крысам. Подсчет колоний в селезенках проводили на 7- 11-е сутки после облучения реципиентов. 6. Определение самообновления КОЕ-С. Облученным первичным реципиентам вводили внутривенно взвесь клеток печени 14-суточного зародыша или костного мозга. Через 7 и 11 суток животных забивали. На 16 каждый исследуемый срок половину селезенок использовали для определения числа колоний, другую половину - для приготовления взвеси клеток и ретрансплантации их в дозе 10 клеток/жив (0,2-3,7 колоний/жив) вторичным реципиентам. На 11 сутки проводили раздельную ретрансплантацию клеток крупных и мелких колоний. Для этого под бинокулярной лупой вырезали участки селезенки с крупными колониями и отдельно приготовляли взвесь клеток из ткани селезенки, содержащей крупные и мелкие колонии. Величину индекса самообновления каждой категории КОЕ-С определяли, как соотношение числа вторичных КОЕ-С, приходящихся на одну первичную КОЕ-С. 7.3Н-тимидиновое и 3Н-уридиновое «самоубийство». Взвесь клеток костного мозга экспонировали с радиотоксическими дозами изотопа in vitro в течение 30-60 минут. Доза 3Н-тимидина составляла 50 мкКю/мл (удельная активность — 12,5 Кю/мМ), доза Н-уридина — 50-75 мкКю/мл (удельная активность 16-23 Кю/мМ). Затем суспензию дважды центрифугировали, отмывая осадок средой 199 с холодным уридином или тимидином. При введении 3Н-тимидина и 3Н-уридина in vivo животные получали соответственно 50мкКю/г (удельная активность - 12,5 Кю/мМ) и 50-75 мкКю/г (удельная активность 16-23 Кю/мМ). Контрольные животные или образцы клеточной взвеси экспонировали с холодным тимидином, соответственно с 400 мкг/жив или 30 мкг/мл. 8. Оксимочевиновое «самоубийство». Оксимочевину в дозе 0,9 мг/г вводили а) внутривенно в 0,3 мл среды 199 облученным реципиентам непосредственно после трансплантации взвеси кроветворных клеток (Monette, Demers, 1982). Контрольным животным вводили соответствующий объем среды 199. б) внутрибрюшинно в 0,2 мл среды 199 за 1 час до забоя. Контрольным животным вводили 0,2 мл среды. Число клеток в костном мозге от каждого животного-донора подсчитывали отдельно и объединяли равное число клеток от 5-10 животных для последующего введения летально облученным реципиентам или культивирования в жидкостной культуре. Долю КОЕ-С и КОЕ-Ф в S-фазе рассчитывали как разность между числом колоний в селезенке (матрасе), образованных клетками контрольного и обработанного оксимоче-виной костного мозга, деленную на число колоний в контрольном варианте.

Список литературы

Цена, в рублях: (при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)	1425

Скачать бесплатно	25242.doc

Найти готовую работу

ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:

Связаться

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ

15.04.24 Задачи, условия и этапы организации экспериментальной работы

15.04.24 Критерии качества преподавания

15.04.24 Категория нормы в обучающей деятельности

Архив материала для курсовых и дипломных работ

Ссылки:

Счетчики:

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.