У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ
Заказать диплом, курсовую, диссертацию


Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Понравилось
Не понравилось





Книга жалоб
и предложений

 





Название Искусственная эволюция циклодекстрин глюканотрансфераз и ик продуцентов in vitro
Количество страниц 127
ВУЗ МГИУ
Год сдачи 2010
Бесплатно Скачать 22978.doc 
Содержание Содержание
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...5

ВВЕДЕНИЕ...6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Обзор методов искусственной эволюции in vitro...10

1.1.1. Классификация методов...14

1.1.2. Методы, основанные на мутагенезе...17

1.1.3. Методы, основанные на рекомбинации...21

1.1.4. Методы скрининга и селекции...47

1.1.5. Применение ДНК шаффлинга...48

1.1.6. Искусственная эволюция in silico (компьютерное моделирование)...49

1.1.7. Дальнейшие перспективы развития методов искусственной эволюции...51

1.2. Фермент циклодекстрин глюканотрансфераза (ЦГТаза), ее продуценты и продукты реакции

1.2.1. Микроорганизмы — продуценты ЦГТаз...53

1.2.2. Механизм действия и свойства ЦГТаз...56

1.2.3. Свойства и применение циклодекстринов...59

1.2.4. Поиск и получение новых ЦГТазных штаммов...61

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследований...63

2.2. Микробиологические методы

2.2.1. Питательные среды...63

2.2.2. Селективные среды и буферы...64

2.2.3. Условия культивирования и инокуляции...70

2.2.4. Отбор почвенных образцов,

3

получение чистых линий, микроскопия...71

2.3. Биохимические методы

2.3.1. Определение оптической плотности биомассы...71

2.3.2. Определение циклодекстрин глюканотрансферазной активности...71

2.4. Молекулярно-биологические методы исследований

2.4.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК...72

2.4.2. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле...73

2.4.3. Электрофорез фрагментов ДНК в

полиакриламидном геле...74

2.4.4. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля...74

2.4.5. Очистка ДНК хроматографией с ДЭАЭ-целлюлозой...74

2.4.6. Расщепление ДНК рестриктазами...75

2.4.7. Выделение векторной ДНК «медленным» способом...75

2.4.8. Лигирование фрагментов ДНК с векторной ДНК...76

2.4.9. Подготовка компетентных клеток...76

2.4.10. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК...77

2.4.11. Получение одноцепочечной ДНК...78

2.4.12. Фрагментирование ДНК при помощи ДНКазы I и ультразвука...19

2.4.13. ДНК шаффлинг...79

2.4.14. Выделение и очистка тотальной ДНК...81

2.4.15. Геномный шаффлинг...82

2.4.16. ДНК/геномный шаффлинг...83

2.4.17. Анализ тотальных ДНК при помощи метода RAPD...84

2.5. Реактивы и материалы...85

2.6. Составы использованных стандартных растворов...87

4

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Проведение асимметричного ДНК шаффлинга

(с одно и двуцепочечными ДНК)...88

3.2. Скрининг и отбор штаммов для геномного шаффлинга...97

3.3 Проведение геномного шаффлинга между

алкалофильным штаммом Bacillus sp. 12 и

ЦГТазным штаммом Bacillus sp. 1069...98

3.4. Скрининг и отбор штаммов для ДНК/геномного шаффлинга 1... 100

3.5. Проведение ДНК/геномного шаффлинга между алкалофильным штаммом Bacillus sp. 9 и

ЦГТазным штаммом Paenibacillus sp. 1005...102

3.6. Скрининг и отбор штаммов для ДНК/геномного шаффлинга2... 107

3.7. Проведение ДНК/геномного шаффлинга между ЦГТазным штаммом Paenibacillus sp. 839 и алкалофильным денитрификатором Bacillus nitritophilus IB-256...110

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...121

ВЫВОДЫ...126

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...127

Введение



СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.к. - аминокислотные остатки

ВКМ - всероссийская коллекция микроорганизмов

дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфаты

ДЭАЭ-целлюлоза — диэтиламиноэтил целлюлоза

о.е. - оптические единицы

о.п. — оптическая плотность

ПНР - полимеразная цепная реакция

СП - степень полимеризации

ДТТ - дитиотрейтол

п.н. - пар нуклеотидов

оц ДНК - одноцепочечная ДНК

дц ДНК - двуцепочечная ДНК

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ТАЕ - трис-ацетатный буфер

ТЕ - трис-буфер

УЗ - ультразвук

ЦГТаза - циклодекстрин глюканотрансфераза

ЦД - циклодекстрины

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

CSI - Classical strain improvement, классические методы по улучшению штаммов

IPTG - изопропилтио-Р-О-тиогалактозид

LB-среда - среда Лурия-Бертани

PVP -поливинилпирролидон

RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA

SDS - додецилсульфат натрия

X-gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-тиогалактопиранозид

6 ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Искусственная (направленная) эволюция белков как новое течение в биотехнологии возникла в качестве инструментария для осуществления белковой инженерии. По сути, искусственная эволюция, в отличие от эволюции естественной, является более избирательной, имеет определенную специфическую цель, ограничена во времени, и, главное, контролируется экспериментатором, хотя ее ключевые процессы (мутации, рекомбинация и скрининг) в общем имитируют естественно протекающие в природе процессы.

Работы по направленной эволюции белков, а именно по химическому и радиационному мутагенезу, начали проводиться с начала 80-х гг. Начало 90-х гг. знаменует собой наступление промышленной эры молекулярной биотехнологии. Бурное развитие этой отрасли, рост числа предприятий диктует необходимость получения новых, безопасных для здоровья человека биокатализаторов естественного происхождения. В 1994 г. появляется принципиально новый подход в молекулярной эволюции - ДНК шаффлинг (от английского слова "shuffling" - перетасовка), который указал перспективу перехода от работ по мутагенезу к использованию рекомбиногенных методов или, иначе, от простой асексуальной репродукции in vitro к сексуальной. С момента опубликования первых данных об удачном осуществлении экспериментов по ДНК шаффлингу (Stemmer, 1994a; 1994b) эта техника получила широкое распространение и практическое применение. На его основе было создано множество методов (Zhao et al., 1998; Ostermeier, 1999; Abecassis et al., 2000; Gibbs et al., 2001; Ness et al., 2002; Zha et al., 2003). Еще одним толчком к развитию методов направленной эволюции послужил переход от работ на уровне субгеномных фрагментов к целым микробным геномам с

целью аккумуляции и комбинирования полезных мутаций от двух и более искусственно выбранных «родителей» в одном организме.

В качестве модели для наших экспериментов по искусственной эволюции in vitro был выбран промышленно важный фермент циклодекстрин глюканотрансфераза (ЦГТаза) и его продуценты. ЦГТаза обладает уникальным свойством превращать крахмал в циклодекстрины (ЦД), широко применяемые в различных отраслях промышленности. Способность к синтезу этого фермента встречается среди прокариот очень редко, что позволяет использовать этот признак в качестве маркерного и проводить селекцию с большой точностью.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение возможности осуществления in vitro ДНК шаффлинга между ранее секвенированными генами а- и (3- ЦГТаз, клонированными в плазмиде pBluescript SK(-), и имеющими около 60% гомологии на нуклеотидном уровне; изучение возможности получения in vitro химерных циклодекстриногенных штаммов при помощи геномного и ДНК/геномного шаффлинга. Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:

1. Выделение одноцепочечных и двуцепочечных ДНК а- и (3- ЦГТаз, клонированных ранее в плазмидном векторе pBluescript SK(-) и получение их фрагментов размером 150-300 пар нуклеотидов;

2. Проведение двухраундового ДНК шаффлинга путем рекомбинации одноцепочечных и двухцепочечных ДНК, взятых в разных пропорциях, для получения случайным образом восстановленного полноразмерного гена;

3. Скрининг и селекция кандидатов для геномного и ДНК/геномного шаффлинга среди ЦГТазных штаммов и почвенных изолятов;

4. Проведение геномного шаффлинга при помощи слияния протопластов между циклодекстриногенным и алкалофильным бациллярными штаммами;

5. Проведение ДНК/геномного шаффлинга посредством трансформации протопластов алкалофильного штамма тотальной ДНК ЦГТазного штамма (схема 1) и осуществление трансформации протопластов ЦГТазного штамма тотальной ДНК галоалкалофильного бациллярного штамма (схема

2);

6. Скрининг и селекция клонов, обладающих амилолитической и ЦГТазной активностью, полученных в результате геномного и ДНК/шаффлинга; сравнительный анализ отобранных и исходных штаммов методом RAPD. Научная новизна работы. Впервые проведен асимметричный ДНК

шаффлинг генов а- и р- ЦГТаз с использованием исходных матричных ДНК, представленных разными формами этой молекулы, взятыми в различных пропорциях для преимущественного отжига 5'—»3'-цепи ДНК от одной ЦГТазы и 3'->5'-цепи другой. Проведен межвидовой однонаправленный перенос генов in vitro путем индуцированной полиэтиленгликолем (ПЭГ) трансформации регенерирующих протопластов одного бациллярного штамма с помощью тотальной ДНК другого и впервые получены жизнеспособные химерные конструкции, обладающие наряду с сохранением прежних (ЦГТазной активности) и новыми свойствами (способностью к анаэробному росту в присутствии нитрата и/или нитрита, рН-толерантностью и солеустойчивостью). Таким образом была показана возможность осуществления искусственной эволюции in vitro применительно к нашей модели исследования и разработаны соответствующие методы.

Практическая значимость работы. Разработан метод асимметричного ДНК шаффлинга, позволяющий повысить выход химерных конструкций, состоящих из фрагментов родительских генов, и предложен метод однонаправленного переноса генетического материала при помощи межвидовой высокоэффективной трансформации бактериальных протопластов тотальной ДНК другого организма. В результате ДНК/геномного шаффлинга

получены штаммы рН- и галотолерантных рекомбинантов, обладающие ЦГТазной активностью и способные к росту в анаэробных условиях на среде с нитратом и нитритом. Полученные химерные культуры могут быть использованы в качестве модели для дальнейших исследований, а также для создания промышленных продуцентов ЦГТаз.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 52-й конференции студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ (Уфа, 2001); на IV республиканском конкурсе научных работ студентов РБ (Уфа, 2002); на III Съезде Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002); на 6-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2002); на XIV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002); на 11-том Европейском Конгрессе по Биотехнологии (Базель, Швейцария, 2003); на II конкурсе научных работ молодых ученых и аспирантов УНЦ РАН и АН РБ (Уфа, 2003); на XVI зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования; главы, посвященной результатам собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 22 рисунками. Библиографический указатель включает 15 отечественных и 240 зарубежных источников литературы.

Список литературы
Цена, в рублях:

(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)		 1425
Скачать бесплатно 22978.doc 





Найти готовую работу


ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:


Связаться

Доставка любой диссертации из России и Украины

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ


Ссылки:

Выполнение и продажа диссертаций, бесплатный каталог статей и авторефератов

Счетчики:

Besucherzahler
счетчик посещений

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.