Бесплатно скачать, заказать диплом, курсовую, диссертацию Исследование структуры актинопоринов актиний Oulactis orientalis и Eadianthus macrodactylus

У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ

Сделать закладку на сайт

Заказать диплом, курсовую, диссертацию

Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Книга жалоб
и предложений

Название	Исследование структуры актинопоринов актиний Oulactis orientalis и Eadianthus macrodactylus

Количество страниц	95

ВУЗ	МГИУ

Год сдачи	2010

Содержание	Содержание Список сокращений...3 Введение...4 2. Литературный обзор...5 2.1. Классификация пороформирующих токсинов (ПФТ)...5 2.2. Структура и механизм действия а-пороформирующих токсинов...8 2.2.1. Колицин...8 2.2.2. Актинопорины...11 2.2.2.1. Первичная структура актинопоринов...13 2.2.2.2. Вторичная и третичная структура актинопоринов...15 2.2.2.3. Механизм действия актинопоринов...18 2.3. (З-Пороформирующие токсины...22 2.3.1. Холестеринзависимые цитолизины...22 2.3.2. Стафилококковый сс-гемолизин...27 2.3.3. Антиген сибирской язвы...29 2.4. Пороформирующие антимикробные пептиды...31 2.4.1. Механизм трансмембранного действия антимикробных пептидов...33 2.4.2. Секропины...35 2.4.3. Магаинины...38 2.4.4. Дермасептины...38 2.4.5. Мелиттин...39 2.4.6. Аламетицин...42 2.4.7. Пардаксин...44 2.5. Заключение...45 3. Результаты и обсуждение...48 3.1. Поиск биологически активных полипептидов в актиниях Японского и Охотского морей...48 3.2. Выделение и физико-химические свойства актинопоринов из О. orientalis...52 3.3. Структура актинопоринов актиний О. orientalis и R. macrodactylus...62 3.3.1. Установление Л^-концевой аминокислотной последовательности актинопоринов Ог-АиОг-G...63 3.3.2. Установление полной аминокислотной последовательности актинопоринов О. orientalis...65 3.3.3. Установление полной аминокислотной последовательности...72 Radianthus актинопорина RTX-A...72 3.3.4. Исследование структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов...76 4. Экспериментальная часть...86 4.1. Материалы...86 4.2. Методы...87 5. Выводы...94 6. Литература...95 Список сокращений Aib — аминоизомасляная кислота IPTG - изопропил-Р-1)-тиогалактопиранозид MALDI-TOF - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация с использованием время-пролетного анализатора pdb — белковая база данных pi - изоэлектрическая точка rsmd — среднеквадратичное отклонение X-Gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-?>-галактопиранозид а.о. — аминокислотный остаток БЛМ - бислойные липидные мембраны ГЛПа - глицин-лейциновый пептид в амидной форме ЗА — защитный антиген ЛФ — летальный фактор ОФ - отечный фактор п.о. — пара олигонуклеотидов ПЦР - полимеразная цепная реакция ПФО - перфринголизин О ПФТ- пороформирующие токсины ТМН - трансмембранный регион ХЗЦ — холестеринзависимые цитолизины ФПК — фрагмент предшественника ксенопина ФПС - фрагмент предшественника каерулина Введение Одной из фундаментальных задач физико-химической биологии является выяснение молекулярных основ функционирования биологических мембран, выполняющих ряд важнейших для клеток функций. Мембрана является границей раздела в клеточной компартментализации, через нее осуществляются контакты клеток друг с другом и с окружающей средой, она также защищает клетку от действия агрессивных факторов окружающей среды. Важное направление в современных исследованиях составляет изучение механизмов транспорта ионов и метаболитов через мембраны, липид-белковых и белок-белковых взаимодействий в мембране, играющих ключевую роль в ряде биологических процессов. Многие из этих процессов жизненно важны для клеток, а некоторые из них ответственны за их гибель. Общепризнанными и универсальными инструментами в этих исследованиях являются а- и (3-пороформирующие токсины (ПФТ), группа цитолитических полипептидов и белков, продуцируемая как прокариотическими, так и эукариотическими клетками. ПФТ многих бактерий являются инвазивными факторами ряда опасных заболеваний, что и предопределяет необходимость всестороннего изучения их структуры и механизма действия. Наиболее изученными представителями ПФТ, наряду с холестеринингибируемыми цитолизинами грамположительных бактерий, являются сфингомиелинингибируемые цитолизины актиний — актинопорины. Уникальная пространственная организация и способность формировать в мембранах поры лежат в основе антиопухолевой, кардиостимулирующей, антипаразитарной и других видов биологической активности актинопоринов, т.е. ПФТ являются перспективными соединениями для создания новых лекарственных препаратов. Настоящая работа является частью исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по изучению структуры и функции биологически активных полипептидов актиний. Данная работа посвящена поиску, изучению физико-химических свойств, установлению структурно-функциональных взаимоотношений актинопоринов тропической актинии Radianthus macrodactylus и актинии Японского моря Oulactis orientalis. 5 2. Литературный обзор Цитолитические токсины белковой природы продуцируют бактерии, насекомые, ядовитые рептилии, жалящие морские беспозвоночные. К настоящему времени охарактеризовано более 300 белковых токсинов и, по крайней мере, треть из них действует, разрушая клеточные мембраны [1]. Многие из этих токсинов формируют поры в клеточных мембранах, что приводит к дезорганизации их структуры и, в конечном итоге, к потере морфологической и функциональной целостности клеток (рис. 1). Поэтому в настоящее время токсины, обладающие мембранолитическим действием, принято называть пороформирующими токсинами (ПФТ). 2.1. Классификация пороформирующих токсинов (ПФТ) Современная классификация ПФТ основана на характерных структурных особенностях, в соответствии с которыми их делят на а- и р-ПФТ. Установлено, что в образовании пор а-ПФТ участвуют в основном а-спиральные участки молекулы. Такие токсины имеют тенденцию к а-спирализации. Поры формируются доменами, а-спиральными шпильками, расположенными в середине трехслойной молекулы, состоящей до десяти а-спиралей. Предполагается, что эти шпильки ответственны за начальные стадии проникновения токсина в мембрану. Типичными представителями этого класса являются пороформирующие колицины Escherichia coli [2], экзотоксин из Pseudomonas aeruginosa [3], некоторые инсектицидные 5-эндотоксины (из двух мультигенных семейств Cry и Cyt) из Bacillus thuringiensis [4] и дифтерийный токсин из Corynebacterium diphtheriae [5] (рис. 2). Относящиеся к группе Р-ПФТ полипептиды, в отличие от высоко спирализованных а-ПФТ, представляют собой многодоменные структуры с преобладанием р-баррельного типа. В этот класс входят аэролизин [6], а-гемолизин из Staphylococcus aureus [8], цитотоксин из Pseudomonas aeruginosa [6], антиген сибирской язвы [9], семейство холестеринзависимых цитолизинов [10]. До сих пор мало известно о том, как токсины этого класса включаются в мембрану, хотя согласно последним исследованиям предполагается, что они имеют общий механизм взаимодействия с мембраной [11]. Бактериальная клетка - продуцент токсина Связывание токсина с поверхностью клетки-мишени Олигомеризация молекул токсина на поверхности клетки-мишени Внедрение в клеточную мембрану Рис. 2. Ленточная диаграмма структур некоторых представителей а-ПФТ [6]. Темным цветом выделены участки молекул, ответственные за пороформирующую активность токсинов. (А) Колицин 1а из Е. coli [7]. (Б) Экзотоксин А из P. aeruginosa [3]. (В) Cry инсектицидный 8-эндотоксин из В. thuringiensis [4]. (Г) Дифтерийный токсин из С. diphtheriae [5]. 2.2. Структура и механизм действия сс-пороформирующих токсинов а-ПФТ, продуцируемые различными видами живых организмов, действуют на клетки бактерий, насекомых, млекопитающих [6]. Мало похожие на первый взгляд структуры всех а-ПФТ имеют высоко а-спирализованные домены (рис. 2). Предполагается, что за каждый этап взаимодействия с мембраной, а именно, связывание с рецептором, транслокационное внедрение в мембрану, а также токсическое действие, отвечают определенные домены [6]. В доменах а-ПФТ, ответственных за формирование пор, может присутствовать как одна (например, у эквинатоксинов), так и несколько а-спиралей (так называемый пучок). Этот пучок имеет трехслойную структуру, состоящую из 6-10 а-спиралей, где каждый слой сформирован с помощью одной/двух или более антипараллельных а-спиралей, некоторые из которых полностью спрятаны внутри пучка. Первоначальное взаимодействие токсина с мембраной включает «распластание» пучка а-спиралей полипептида на поверхности мембраны. Проникновение в липидный слой сопровождается изменением конформации молекулы. Несмотря на близкий механизм порообразования у всех а-ПФТ, подобия в аминокислотной последовательности пороформирующих доменов не обнаружено [6]. 2.2.1. Колицин Типичным представителем а-ПФТ является колицин А, на примере которого был продемонстрирован механизм действия а-ПФТ [12, 13]. Полипептидная цепь колицина А состоит из 204 а.о., которые образуют 10 а-спиралей, формирующих трехслойную структуру (рис. ЗА). Установлено, что восьмая и девятая а-спирали находятся внутри трехмерной структуры [12]. На основании этой структурной особенности молекулы была предложена «зонтичная» модель проникновения токсина в мембрану. Согласно этой модели гидрофобная петля шпильки, состоящей из восьмой и девятой а-спирали, инициирует взаимодействие токсина с липидным бислоем путем полного внедрения в него (рис. 3 Б) [13]. Проникновение заряженных аминокислотных остатков в мембрану энергетически невыгодно, внедрение шпильки в мембрану инициирует такое конформационное изменение молекулы, при котором, два внешних, обрамляющих восьмую и девятую а-спирали слоя, остаются вне мембраны (подобно раскрытому зонтику). При этом их гидрофобные внешние стороны оказываются расположенными на поверхности бислоя (рис. ЗБ) [13]. «Зонтичная» модель была тщательно проверена экспериментально. Методом цистеин-сканирующего мутагенеза было показано, что введение дисульфидных связей между 1 и 9, 5 и 6, 9 и 10 а-спиралями приводит к инактивации токсина, так как молекула теряет способность раскрываться в виде зонтика [14]. Методами флуоресцентной спектроскопии было установлено, что гидрофобная шпилька, образуемая 8 и 9 а-спиралями глубоко погружается в липидный бислой, тогда как амфифильные 1-7 и 10 а-спирали располагаются на поверхности мембраны [15]. Последующие конформационные изменения затрагивают все гидрофобные шпильки, образуемые 3, 4, 5, 6 и частично 7 а-спиралями, что приводит к дальнейшему включению их в липидный бислой (рис. ЗВ) [16, 17]. По-видимому, положительный заряд аминокислотных остатков а-спиралей, кольцом окружающих гидрофобную шпильку, играет важную роль в первоначальном электростатическом взаимодействии колицина А с отрицательно заряженными липидами мембран и в ориентации молекулы, необходимой для внедрения шпильки в мембрану [18]. Кроме того, важным для конформационных перестроек молекулы колицина А, происходящих при включении ее в мембрану, является наличие остроконечных полостей в белковом коре (рис. ЗА) [12]. Установлено, что формирующий пору домен колицина А переходит в состояние расплавленной глобулы, при этом разрушается его третичная структура, но сохраняется вторичная [19, 20]. В промежуточном состоянии расплавленной глобулы уменьшается энергетический барьер для «раскрытия» гидрофобной шпильки при ее встраивании в мембрану [21]. Данное состояние молекулы инициируется низким значением рН на поверхности мембран, содержащих кислые липиды. Рис. 3. «Зонтичная» модель взаимодействия пороформирующего домена колицина А с мембраной. А: Токсин приближается к мембране. Б: «Зонтичная» конформация в закрытом состоянии канала. В: Предполагаемая конформация открытого состояния канала. Эта модель допускает олигомеризацию или образование белок-липидной поры. Для простоты показан только один мономер [6]. Показано, что мутантная форма колицина А, у которого отсутствуют 1 и 3 а-спирали, полученная усекающим мутагенезом, также обладает порообразующей активностью [22]. С помощью сайт-направленного мутагенеза колицина А установлено, что для формирования канала важны 5 и 9 а-спирали молекулы [23]. Изучение пороформирующей активности природного и расщепленного протеазами колицина показало, что каналы мутантных форм состоят максимум из 6 а-спиралей [2]. Ряд авторов [24, 25] отмечает трудность в согласовании предлагаемой модели с экспериментальными данными, указывающими на наличие дискретных каналов с диаметром в 10 А, которые образует токсин. 2.2.2. Актинопорины Одним из наиболее изученных классов а-ПФТ являются цитолитические токсины, продуцируемые актиниями [26]. По мнению исследователей, они синтезируются и локализуются вместе с другими компонентами ядовитого секрета в нематоцистах [27]. Наиболее многочисленную и хорошо изученную группу цитолизинов, выделенных в основном из тропических видов актиний, составляют полипептиды с молекулярной массой 15-20 кДа [26, 28, 29-32]. Благодаря своей способности образовывать поры в биологических мембранах они получили название актинопорины [26]. В таблице 1 приведены физико-химические характеристики некоторых актинопоринов актиний Stichodactyla helianthus [33], Actinia equina и Actinia tenebrosa [34], Heteractis magnijica [35]. Это, как правило, высокоосновные полипептиды с изоэлектрической точкой (pi) 9-12. Характерной особенностью их аминокислотного состава является отсутствие остатков цистеина и высокое содержание основных и гидрофобных аминокислотных остатков. Токсичность актинопоринов, оцениваемая летальной дозой для мышей (ЛД5о), колеблется в пределах от 23 до 320 мкг/кг, что позволяет отнести их к высокотоксичным соединениям. 12 Таблица 1 Физико-химические характеристики актинопоринов некоторых видов актиний Источник цитолизина Молекулярная масса, кДа мышах, мюткг Pi Гемолитическая активность (ГЕЛ1Г) Actiniidae Actinia cari [30] каритоксин I 19.8 54 9.45 7.0x103 каритоксин II 19.8 91 10.0 5.8xlO3 Actinia equina [34] эквинатоксин I 19 23 9.8 эквинатоксин II 19 35 10.5 эквинатоксин III 19 83 10.5 Actinia tenebrosa [34] тенебросин-А 19.8 9.4 7.1xlO5 тенебросин-В 19.4 9.4 2.3xlO5 тенебросин-С 20.2 >10 1.7x105 Aliciidae Phyllodiscus semoni [38] PsTX-20A 1.25xlO4 Sagartiidae Sagartia rosea [39] Srcl 19.6 4.8 1.1бхЮ3 Stichodactylidae Heteractis magnifica [35] магнификализин I 19 140 9.4 3.6x104 магнификализин II 19 320 10.0 З.ЗхЮ4 Radianthus macrodactylus [29] RTX-A 20 50 9.8 3.5x104 RTX-S 20 50 9.8 1.0x104 RTX-G 20 100 10.5 5.0хЮ4 RTX-S II [32] 19.28 70 10 З.бхЮ4 Stichodactyla helianthus [33] цитолизин I 17.6 8.7 O.91xlO4 цитолизин II 17.6 9.5 3.14хЮ4 цитолизин III 17.5 100 9.7 4.82хЮ4 цитолизин IV 19.2 9.8 1.67x104 Актинопорины являются термолабильными полипептидами: с увеличением температуры от 40 до 60°С наблюдается уменьшение их гемолитической активности [36]. Прединкубация этих полипептидов с экзогенным сфингомиелином (СМ) приводит к потере их гемолитической активности, поэтому они получили название сфингомиелинингибируемые цитолизины [37]. 2.2.2.1. Первичная структура актинопоринов В последнее десятилетие благодаря применению методов структурной химии белка и молекулярной биологии (расшифровка кодирующих аминокислотные последовательности полипептидов мРНК и кДНК) установлены полные первичные структуры десяти актинопоринов (рис. 4). Структуры восьми актинопоринов, EqtII, IV и V из A. equina [40, 41, 42], StI и StII из S. helianthus [43], HmgUI из Н. magnified [44], цитолизинов PsTX-20A из Phyllodiscus semoni [38] и Src I из Sagartia rosea [39], были установлены с помощью рекомбинантных ДНК (рис. 4). Показано, что зрелые полипептиды состоят из 175-179 аминокислотных остатков. Отмечена высокая степень гомологии //-концевых аминокислотных последовательностей для актинопоринов актиний, принадлежащих к двум различным семействам, Actiniidae и Stichodactylidae. Так для HmgUI, StI и StII, TnC и EqtII степень гомологии составила 91, 89, 65 и 63%, соответственно. Рентгеноструктурный анализ кристаллических структур StII и EqtII показал, что iV-концевой фрагмент молекулы имеет сс-спиральную конфигурацию [45, 46]. Было высказано предположение, что именно этот участок молекулы проникает в липидный бислой при взаимодействии актинопорина с мембраной [47]. Интересной особенностью всех аминокислотных последовательностей всех известных актинопоринов является наличие триптофанобогащенного высококонсервативного участка (WYSNWW). Подобный участок присутствует также в структурах р-пороформирующих токсинов, таких как холестеринингибируемые цитолизины грамположительных бактерий, для которых было показано, что этот участок взаимодействует с липидным матриксом мембран [48]. Рис. 4. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей актинопоринов. Sti, StII: стихолизин I (код Genbank, P81662) и стихолизин II (код Genbank, P07845) из S. helianthus [43]. Hmglll, HMT: магнификализин III (код Genbank, Q9U6X1), магнификализин [44, 49] из Н. magnified. TenC: тенебросин С (код Genbank, Р17723) из A. tenebrosa [50]. EqtII, EqtIV, EqtV: эквинатоксин II (код Genbank, P17723), эквинатоксин IV (код Genbank, Q9Y1U9), эквинатоксин V (код Genbank, Q93109) из А. equine [40-42]. PsTX: актинопорин из P. semoni [38]. Srcl: кислый актинопорин из S. rosea [39]. Консенсус последовательностей представлен внизу. Идентичные аминокислотные остатки во всех последовательностях отмечены черным цветом. Выравнивание выполнено с помощью программы CLUSTALW [51]. В 2002 г. был впервые клонирован и экспрессирован актинопорин Src I из S. rosea (Anthozoa, Sagartiidae) (рис. 4), имеющий pi 4.8 и молекулярную массу 19600 Да [39]. При анализе аминокислотного состава и последовательностей Src I и EqtII оказалось, что EqtII содержит 14.4% основных аминокислот и 9.4% кислых аминокислот, тогда как Src I — 9.6% и 11.3%, соответственно. Сравнение первичной структуры кислого цитолизина Src I со структурами основных актинопоринов показало высокую степень гомологии (от 71 до 76%). Существенные отличия наблюдаются в количестве основных и кислых аминокислотных остатков в С-концевых фрагментах молекул. Было высказано предположение, что значение pi этих актинопоринов главным образом определяется аминокислотными остатками в С-концевом участке молекулы, так как именно этот фрагмент (60 аминокислотных остатков), по сравнению с остальной частью молекулы, обогащен или основными, или кислыми аминокислотами [39]. 2.2.2.2. Вторичная и третичная структура актинопоринов При исследовании актинопоринов методами КД- и ИК-спектроскопии обнаружено, что они являются р-структурированными полипептидами. Установлено, что StI и StII содержат 44-50% р-складчатых структур, 18-20% Р-изгибов, 12-15% а-спирали и 19-22% неупорядоченной структуры [52]. Эти результаты согласуются с данными рентгеноструктурного анализа EqtII, согласно которому он имеет 47.5% Р-складчатых структур, 9.5% а-спирали и 47.5% неупорядоченной структуры и Р-изгибов [45, 53]. Вторичная структура актинопоринов достаточно устойчива в большом интервале температур и рН. При рН ниже 1.1 и выше 10.0 или увеличении температуры выше 53°С EqtII и StII переходят в состояние расплавленной глобулы [54-57]. В интервале рН 7—10 происходит частичное развертывание структуры молекулы, которое характеризуется незначительным перераспределением в содержании элементов вторичной структуры [56, 57]. Как было показано ранее [58-60], именно в этом диапазоне рН гемолитическая активность актинопоринов максимальна. При рН 11 происходит полное разрушение третичной структуры, увеличение нерегулярной спиральной структуры, что переводит актинопорин в водонерастворимое состояние [57]. Показано, что увеличение ионной силы раствора StI [60] и RTX-A [36] приводит к заметному увеличению его гемолитической активности. Этот эффект связан с частичным развертыванием молекулы полипептида в присутствии повышенной концентрации солей [56, 57], что также объясняет неспецифичное увеличение гемолитической активности, вызываемое ионами Са2+, Mg2+, Ba2+ и некоторыми другими двухвалентными катионами в концентрации выше 10 мМ для EqtII [58]. По-видимому, связывание актинопорина с липидной мембраной сопровождается конформационными изменениями его третичной структуры, без каких либо значительных изменений вторичной структуры полипептида.

Список литературы

Цена, в рублях: (при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)	1425

Найти готовую работу

ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:

Связаться

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ

15.04.24 Задачи, условия и этапы организации экспериментальной работы

15.04.24 Критерии качества преподавания

15.04.24 Категория нормы в обучающей деятельности

Архив материала для курсовых и дипломных работ

Ссылки:

Счетчики:

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.