У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ
Заказать диплом, курсовую, диссертацию


Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Понравилось
Не понравилось





Книга жалоб
и предложений

 





Название Исследование ассоциации ряда генов системы гемостаза с ишемической Болезнью сердца
Количество страниц 109
ВУЗ МГИУ
Год сдачи 2010
Бесплатно Скачать 24800.doc 
Содержание Содержание
ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...7

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...10

1.1. Полиморфные маркеры...11

1.1.1. Типы полиморфизмов и методы их исследования...11

1.1.2. Использование полиморфных маркеров в исследовании

генетики многофакторных заболеваний...16

1.2. Ишемическая болезнь сердца...20

1.2.1. Основные аспекты этиологии и патогенеза ишемической

болезни сердца...20

1.2.2. Генетические факторы риска развития

ишемической болезни сердца...23

1.2.3. Инфаркт миокарда...25

1.3. Система гемостаза...27

1.4. Характеристика исследованных в работе генов и

полиморфных маркеров...:...40

1.4.1. Ингибитор активатора плазминогена типа 1. Ген PLANH1. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС и ИМ...40

1.4.2. Фактор свертывания крови V. Ген F5. Полиморфные маркеры

гена и их ассоциацияс ИБС и ИМ...44

1.4.3. Интегрин allbp3. Ген ITGB3. Полиморфные маркеры гена, и их ассоциация с ИБС и ИМ...48

1.4.4. Ген ITGA2B. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС

и ИМ...52

1.4.5. Фактор свертывания крови VII. Ген F7. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС и ИМ...54

1.4.6. Протеин С. Ген PROC. Полиморфные маркеры гена

и их ассоциация с ИБС и ИМ...58

1.4.7. Тромбомодулин. Ген THBD. Полиморфные маркеры гена

4

и их ассоциация сИБСиИМ...58

1.4.8. Фибриноген. Ген FGB. Полиморфные маркеры гена

и их ассоциация с ИБС и ИМ...62

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...68

2.1. Реактивы и ферменты...68

2.2. Буферные растворы...69

2.3. Формирование групп больных и здоровых индивидов...70

2.4. Выделение геномной ДНК...71

2.5. Амплификация ДНК...71

2.6. Расщепление продуктов амплификации рестриктазами...73

2.7. Электрофоретическое разделение ДНК...74

2.8. Определение уровня фибриногена в крови...75

2.9. Статистическая обработка результатов...76

2.9.1. Сравнение выборок по частотам аллелей и генотипов.

Точный критерий Фишера...76

2.9.2. Оценка отношения шансов. Доверительный интервал...76

2.9.3. Построение кривых Каплана-Мейера...77

2.9.4. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей...77

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ...78

3.1.1. Исследование ассоциации полиморфного маркера 4G(-675)5G генаР/ЛМ/7сИБСиИМ...78

3.1.2. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Arg506Gln, Arg306Thr и С(-42б)Тгена F5 с ИБС и ИМ...81

3.1.3. Исследование ассоциации полиморфного маркера А1А2 гена ITGB3 с ИБС и ИМ...85

3.1.4. Исследование ассоциации полиморфного маркера НРА—За/ЗЬ

гена ITGA2B с ИБС и ИМ...88

3.1.5. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Arg353Gln

и G73A гена F7 с ИБС и ИМ...89

3.1.6. Исследование ассоциации полиморфных маркеров С(—1654)Ти

5

A(-1641)G гена PROC с ИБС и ИМ...93

3.1.7. Исследование ассоциации полиморфного маркера Ala455Val

гена THBD с ИБС и ИМ...96

3.1.8. Исследование ассоциации полиморфного маркера G(-455)A

гена FGB с ИБС и ИМ...98

3.2. Исследование ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с неблагоприятным исходом ИБС...102

3.2.1. Изучение ассоциации полиморфного маркера С(—1654)Тгена PROC с неблагоприятным исходом ИБС...104

3.2.2. Изучение ассоциации полиморфного маркера G(-455)A гена FGB

с неблагоприятным исходом ИБС...106

4. ВЫВОДЫ...108

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...109

Введение



ВВЕДЕНИЕ.

В настоящее время сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной инвалидности и смертности в экономически развитых странах (Boerwinkle, 1996), при этом на долю ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда приходится примерно две трети случаев смерти от сердечно-сосудистых заболеваний.

Известно, что данные сердечно-сосудистые патологии являются многофакторными заболеваниями с многочисленными звеньями патогенеза. Для таких заболеваний характерен сложный механизм формирования фенотипа, в основе которого лежит взаимодействие генетических факторов с факторами внешней среды (Galtion, 1995). При этом для каждого конкретного заболевания можно выделить группу так называемых генов-кандидатов, продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие данной патологии.

Исследование молекулярно - генетических основ многофакторных заболеваний относится к одной из наиболее серьезных задач современной генетики. Знание генетических факторов, предрасполагающих к развитию заболевания и его осложнений, имеет важное прогностическое значение и может использоваться при досимптоматической диагностике, т.е. до появления каких-либо клинических или биохимических симптомов болезни.

Современная стратегия исследования генетической составляющей многофакторных заболеваний включает в себя поиск полиморфных маркеров в генах, могущих вносить вклад в развитие заболевания (генах-кандидатах) и оценку их ассоциации с заболеванием (Пузырев, 1997). Под ассоциацией полиморфного маркера с заболеванием понимают достоверно различающуюся частоту встречаемости определенного аллеля

или генотипа этого маркера у больных и у здоровых лиц одной и той же популяции.

Установление ассоциации гена с заболеванием и последующая оценка индивидуального генетического риска имеют важное значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению данной патологии и ее осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного пациента. Подобные исследования позволяют точнее и надежнее оценивать генетический риск развития заболевания и прогнозировать его течение.

Исходя из современных представлений о механизмах развития ИБС, можно выделить группу кандидатных генов, белковые продукты которых участвуют или потенциально могут быть вовлечены в патогенез ИБС и ее осложнений. Среди таких генов-кандидатов особого внимания заслуживают гены системы гемостаза (Hopkins, 1989), играющие важную роль в развитии данной патологии (Paul, 1999).

Изучение аллельного полиморфизма генов системы гемостаза у больных ИБС и ИМ, а так же у здоровых лиц общей популяции позволило найти аллели, в различной степени ассоциированные с предрасположенностью к развитию этих заболеваний в разных этнических группах.

Цели и задачи работы

Целью данной работы было изучение ассоциации полиморфных маркеров нескольких генов-кандидатов, кодирующих белковые факторы системы гемостаза, с ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов, кодирующих фактор свертывания крови V (F5), фактор свертывания крови VII (F7), |3-цепь фибриногена (FGB), РЗ-субъединицу интегрина allbp3 (ITGB3), allb-субъединицу интегрина allbp3 (ITGA2B), ингибитор активатора плазминогена типа 1 (PLANH1), протеин С (PROC) и тромбомодулин (THBD) в группах больных ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда, а так же в группе здоровых индивидов среди русских г. Москвы.

2. Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров данных генов-кандидатов в исследованных выборках больных и здоровых индивидов для выявления ассоциации изученных маркеров с развитием болезни и определения вклада данных генов в наследственную предрасположенность к патологии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Полиморфные маркеры. 1.1.1. Типы полиморфизмов и методы их исследования.

В связи с расширением технических возможностей молекулярной биологии и достижениями в изучении генома человека (расшифровка протяженных нуклеотидных последовательностей, картирование генов, изучение их структуры, полиморфизма, регуляции экспрессии и т.д.) началось становление и бурное развитие молекулярной генетики заболеваний.

Широко применяются в современной молекулярной генетике заболеваний полиморфные маркеры — т.е. полиморфные участки генома, ассоциированные с предрасположенностью или устойчивостью к развитию той или иной патологии. Поиск полиморфных маркеров заболевания - это перспективный подход к оценке генетической предрасположенности к мультифакторным генетическим заболеваниям.

Полиморфизм представляет собой наличие нескольких аллельных вариантов гена или участка ДНК. В настоящее время полиморфизм найден в митохондриальной и ядерной ДНК, в кодирующей и не кодирующей частях последней, в ее уникальных и повторяющихся последовательностях (Алтухов, 2002).

Полиморфные участки ДНК можно условно разделить на три группы:

1. Повторяющиеся последовательности ДНК;

2. Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP — single nucleotide polymorphism).

3. Полиморфизм типа вставка/отсутствие вставки (I/D -insertion/deletion).

ю

Повторяющиеся последовательности ДНК делятся на высокоповторяющиеся (свыше 100 тыс. копий на гаплоидный геном), умеренно повторяющиеся (от 10 до 100 тыс. копий) и низкокопийные (2-100 копий). Первые два типа объединяют в группу так называемых рассеяных последовательностей классов SINE и LINE, разбросанных по всему геному в виде единичных мотивов. Последовательности класса SINE состоят из рассеянных элементов длиной менее 500 п.н. (Alu— повторы и т.д.) (Singer, 1982), тогда как в класс LINE входят мотивы размером свыше 500 п.н. Примером последних могут служить повторы типа L\(Kpn), варьирующие по длине от 0.5 до 7 т.п.н. (Jelinek, 1982).

Другой большой группой повторяющихся последовательностей являются тандемные повторы. Они составляют в среднем около 10% генома человека и состоят из следующих друг за другом повторяющихся нуклеотидных звеньев с некоторой общей последовательностью.

Микро- и минисателлитные последовательности состоят из тандемно повторенных копий так называемых «коровых» (от английского "core") последовательностей длиной от двух до нескольких тысяч пар оснований. Микросателлиты — это класс нуклеотидных повторов, включающих от двух до пяти звеньев с размером повторяющегося участка («мотива») 1-6 нуклеотидов (Wright, 1994). Размер повторяющихся единиц в минисателлитных последовательностях может меняться от 9-10 до 100 нуклеотидов (Jeffreys, 1985). Отличительной особенностью микро- и минисателлитов является наличие среди них большого количества участков, вариабельных по числу копий в кластере (варьирующие по числу тандемные повторы - VNTR, variable number of tandem repeats). Индивидуальные аллели таких локусов отличаются друг от друга числом тандемно повторяющихся копий.

Количество высокоизменчивых микро — и минисателлитных последовательностей в геноме человека, по-видимому, превышает

и

несколько десятков тысяч; они достаточно плотно и равномерно расположены в каждой из хромосом (Weissenbach, 1992).

Микросателлиты, обозначаемые так же STR (short tandem repeats) или SSR (simple sequence repeat), также обладают высоким уровнем полиморфизма, исходя из числа «коровых» единиц. Подобно другим повторам, STR обычно встречаются в некодирующих частях генов, однако, изменение числа этих повторов в сторону их увеличения может приводить к нарушению функции генов вплоть до полного блока экспрессии и быть причиной ряда тяжелых наследственных заболеваний (ZupanicI, 1998)

В зависимости от длины повторяющегося звена STR разделяются на моно-, ди-, три-, тетра- и пентануклеотидные микросателлиты. Подавляющее большинство ди— (и более) нуклеотидных микросателлитов полиморфны. Повторяющиеся мотивы (СА)П являются самыми распространенными среди динуклеотидных повторов в геноме млекопитающих (Miesfield, 1981). В ДНК человека предположительно насчитывается от 50 до 100 тыс. блоков (СА)П, содержащих от 15 до 30 звеньев, т.е. в среднем они встречаются через каждые 30-60 т.п.н. (Hamada, 1984). Функции повторов (СА)П не известны, но предполагается, что они являются горячими точками рекомбинации и содержат энхансерные участки, усиливающие экспрессию генов.

Ди-, тетра- и пентануклеотидные микросателлиты отмечены только в некодирующих участках генов и в межгенных областях ДНК...В экзонах обнаружены лишь тримерные тандемные повторы. Тетрануклеотидные мотивы типа АААТ или AAAG, обогащенные остатками аденозина, часто встречаются в виде полиморфных трактов в составе Alu-повторов (Economou,1990). По приблизительной оценке, в геноме человека содержится до 20 тыс. три- и тетрануклеотидных повторов, или в среднем один такой микросателлит на каждые 150 т.п.н. (Edwards, 1991).

12

Вариабельные микро- и минисателлитные повторы являются чрезвычайно информативными системами. Это связано с тем, что они, как правило, состоят из большого количества аллелей с уровнем гетерозиготности, достигающим 70-90%.

Такая высокая вариабельность STR была использована при построении полной карты генома человека (Guyer, 1995).

Общее число высокополиморфных минисателлитных последовательностей в геноме превышает 1500 (Charlesworth, 1994). С помощью ДНК-зондов, сконструированных на основе тандемно повторяющихся «коровых» последовательностей, можно анализировать индивидуальную изменчивость в единичных или множественных высокополиморфных локусах, несущих однотипную «коровую» последовательность.

SNPs (single nucleotide polymorphisms), согласно принятому определению (Brookes, 1999), - это однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в некоторой популяции имеются различные варианты последовательностей (аллели), причём редкий аллель встречается с частотой не менее 1%. Иногда дополнительно определяются "распространённые SNPs", для которых частота встречаемости редкого аллеля больше 20%. В принципе, возможно существование би-, трёх- и четырёхаллельных полиморфизмов. Однако на практике чрезвычайно редки даже трёхаллельные SNP (менее 0,1% всех SNP человека). Число SNP на ген у человека колеблется от 0 до 29, причем в кодирующих последовательностях гена содержится в среднем по 4 SNP (Cargill, 1999). В настоящее время эти маркеры активно изучают в геноме человека (Wang, 1998) для выявления их ассоциации с различными комплексными заболеваниями (Lander, 1996).

Мононуклеотидные полиморфные участки могут быть локализованы как в некодирующих (интроны, промоторные и регуляторные участки), так и в кодирующих областях генов. Наличие

13

полиморфных участков в регуляторных и промоторных областях может влиять на экспрессию гена. Нуклеотидная замена в кодирующей части гена, в случае, если она приводит к замене аминокислоты в полипептидной цепи белка, может влиять на функциональную активность продукта.

Полиморфизмы типа вставка/отсутствие вставки (I/D) наблюдаются как в межгенных областях, так и внутри генов. Полиморфные участки, возникающие в результате вставок и делеций, встречаются гораздо реже нуклеотидных замен. Как правило, они локализованы вне кодирующих областей генов. Размеры вставок могут сильно различаться. Изредка полиморфизм типа I/D встречается в кодирующих областях.

Если точечная мутация происходит в кодирующей области гена, то нередко это вызывает аминокислотную замену, которая может отразиться на изменении свойств и структуры белкового продукта, то есть проявиться на уровне фенотипа. Нуклеотидные замены в регуляторных областях генов также могут влиять на их экспрессию, если происходят в промоторах, затрагивают последовательность Шайна-Дальгарно, либо изменяют последовательность участков связывания регуляторных белков. Точечные замены внутри островков CpG могут воздействовать на их метилирование, значительно изменяя уровень экспрессии генов.

Существует ряд методов, позволяющих детектировать полиморфизмы. Как правило, общей для всех методик является амплификация участка ДНК при помощи ПЦР, затем полученный продукт может анализироваться различными способами.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой метод амплификации ДНК, заключающийся в многократном умножении специфического участка ДНК, ограниченного парой праймеров, комплементарных его последовательности, в условиях in vitro с помощью

14

термостабильной ДНК-полимеразы. Эффективность данного подхода мало зависит от количества и, в существенной мере, независима от качества анализируемой ДНК. ПЦР впервые была осуществлена в 1985 г. для амплифицикации фрагмента [3—глобинового гена человека (Saiki, 1985). Изначально для ПНР использовали фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E.coli, но требовалось вносить этот термолабильный фермент в реакционную смесь после каждого цикла. Позднее для проведения ПЦР стали использовать термостабильную полимеразу, что существенно расширило возможности применения этого метода.

ПЦР представляет собой непрерывный трехступенчатый процесс, повторяемый в каждом цикле и состоящий из денатурации ДНК, отжига праймеров и синтеза новой цепи. На первой стадии каждого цикла при 95°С происходит разделение цепей ДНК, затем при определенной температуре (варьирующей в зависимости от нуклеотидной последовательности используемой пары праймеров) — присоединение (отжиг) праймеров к гомологичным последовательностям на ДНК-мишени. Синтез новых цепей ДНК осуществляется термостабильной ДНК-полимеразой из свободных dNTPs путем достраивания присоединившихся праймеров в направлении 5'->3\ как правило, при температуре 70-72°С (в зависимости от типа полимеразы). Обычно, за 25-40 циклов амплификации можно синтезировать ДНК в количестве, достаточном для последующего анализа. Чувствительность метода позволяет анализировать минимальные количества ДНК, сравнимые с ее количеством в одной клетке (Li, 1988).

Продукты ПЦР анализируют электрофоретически, в агарозном или полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием или азотнокислым серебром для визуализации полос ДНК. При этом окраска препаратами серебра является более чувствительным методом, чем использование бромистого этидия, т. к. позволяет обнаружить до 10 нг ДНК.

15

Метод анализа нуклеотидной последовательности ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) представляет собой амплификацияю интересующего фрагмента и его последующее расщепление соответствующей рестриктазой (Schumm, 1988).

Данный метод применим, если полиморфизм изменяет последовательность ДНК так, что это приводит к образованию или исчезновению сайта рестрикции. В таком случае, продукт ПЦР подвергают обработке соответствующей рестриктазой, и по длине образовавшихся фрагментов, анализируемых электрофоретически, судят о наличии или отсутствии замены в области рестрикционного сайта.

Если полиморфизм не создает и не нарушает сайт рестрикции, то такой сайт может быть создан искусственно за счет внесения изменений в последовательность праймеров. Для этого амплифицируемый участок ДНК выбирают таким образом, чтобы 3'- конец одного из праймеров непосредственно примыкал к полиморфному участку. В последовательности праймера, в области 3 — конца, изменяют один или несколько нуклеотидов так, чтобы в сочетании с нуклеотидом полиморфного участка в этом месте образовывался или нарушался сайт рестрикции (Ngo, 1991). После рестрикции продукты анализируют, как правило, электрофоретически.

1.1.2. Использование полиморфных маркеров в исследовании генетики мультифакторных заболеваний.

Изучение наследственной предрасположенности к

мультифакторным заболеваниям крайне важно для их диагностики и терапии. Для оценки роли наследственных факторов в развитии мультифакторного заболевания, как правило, используют анализ

16

сцепления, анализ ассоциации или экспериментальные модели развития заболевания на животных.

Большую практическую ценность представляет исследование полиморфных маркеров в генах-кандидатах, продукты которых вовлечены в патогенез многофакторного заболевания.

Анализ сцепления основан на определении вероятности совместного наследования фенотипического признака (заболевания) и исследуемого маркера в семье. При этом исследуют совместную сегрегацию генов при передаче от родителей к потомкам в ряду поколений.

При использовании метода идентичных по происхождению аллелей (IBD, identical by descent) информацию о сцеплении получают в результате анализа наследования маркеров в парах больных родственников без предварительного выбора типа наследования и других характеристик. Данный подход заключается в оценке того, насколько чаще по сравнению со случайной сегрегацией пара больных родственников (чаще всего для анализа используют сибсовые пары) наследует один и тот же аллель (Brown, 1994). Анализ сцепления может проводиться с исследованием как ядерных (оба сибса больны), так и простых (один сибс болен, а один здоров) семей. При этом оцениваются шансы (вероятности) за и против сцепления в данной семье. Количественным показателем сцепления является логарифм соотношения шансов (правдоподобия) за и против сцепления - лод-балл (от английского «logarithm of odds ratio»). Сцепление считается подтвержденным, если лод-балл превысит значение 3.0 (т.е. вероятность совместного наследования признака и маркера в 1000 раз больше, нежели вероятность их раздельного наследования) (Ghosh, 1996). Если ни на одной из проанализированных семей не обнаруживается статистически значимое сцепление, лод-балл рассчитывают, используя суммарные данные для нескольких семей. При этом необходим тщательный отбор

Список литературы
Цена, в рублях:

(при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)		 1425
Скачать бесплатно 24800.doc 





Найти готовую работу


ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:


Связаться

Доставка любой диссертации из России и Украины

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ


Ссылки:

Выполнение и продажа диссертаций, бесплатный каталог статей и авторефератов

Счетчики:

Besucherzahler
счетчик посещений

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.