Бесплатно скачать, заказать диплом, курсовую, диссертацию Оптимизация условий культивирования игтаммоб вируса энтерита норок и изучение его Биологический свойств

У нас уже 176407 рефератов, курсовых и дипломных работ

Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Книга жалоб
и предложений

Название	Оптимизация условий культивирования игтаммоб вируса энтерита норок и изучение его Биологический свойств

Количество страниц	147

ВУЗ	МГИУ

Год сдачи	2010

Бесплатно Скачать	24243.doc

Содержание	Содержание 1. Введение...5 2. Обзор литературы...9 2.1. Энтерит норок (историческая справка)...9 2.2. Физико-химические и биологические свойства вируса энтерита норок... 9 2.3. Культуральные свойства вируса энтерита норок... 19 2.4. Некоторые аспекты стандартизации перевиваемых линий клеток...31 2.6. Стабилизация вирусов методом лиофильного высушивания...40 Заключение... 44 3. Собственные исследования... 47 3. 1. Материалы и методы... 47 4. Результаты исследований... 66 4.1. Сравнительная оценка чувствительности первичной и перевивае- мых культур клеток к вирусу энтерита норок... 66 4.2. Стандартизация перевиваемых линий клеток - субстратов для про- изводства вируса энтерита норок... 68 4.2.1. Индикация микоплазм-контаминантов в перевиваемых линиях клеток кошек... 68 4.2.2. Деконтаминация линий клеток кошек при помощи моно- и комплексных препаратов на основе фторхинолонов и поверхностно - активных веществ... 70 4.2.3. Цитометрический анализ клеточного цикла линий клеток CRFKhFS...!... 75 4.2.4. Сравнительное изучение чувствительности линий клеток кошек, инфицированных и деконтаминированных от микоп-лазменной инфекции... 84 4.3. Влияние некоторых факторов на уровень накопления гемагглюти-нинов вируса энтерита норок в монослойных культурах клеток...85 4.3.1. Посевная концентрация клеток... 85 4.3.2. Вид посевного вируса... 87 4.3.3. Доза и способ заражения...88 4.3.4. Время адсорбции вируса...90 4.3.5. Состав питательных сред... 92 4.3.6. Вид сыворотки крови животных... 93 4.3.7. Способ культивирования вируса... 95 4.3.8. Штаммы вируса энтерита норок... 97 4.3.9. Вид антибактериального средства...98 4.4. Серийное пассирование вируса энтерита норок в клеточных куль- турах кошачьего происхождения... 102 4.5. Опытно-промышленное производство вируса энтерита норок...112 4.6. Сравнительное изучение физико-химических свойств различных пассажей вируса энтерита норок...114 4.6.1. Очистка и концентрирование вируса...114 4.6.2. Электронная микроскопия ВЭН... 116 4.6.3. Анализ структурных белков ВЭН методом электрофореза вДСН-ПААГе...117 4.6.4. Выделение, очистка ДНК и анализ генома вируса энтерита норок...118 4.7. Антигенные и иммуногенные свойства штамма «Береговой» вируса энтерита норок различного уровня пассажей в культуре клеток FS... 120 4.8. Высушивание культурального вируса энтерита норок... 123 5. Обсуждение результатов... 129 6. Выводы... 145 7. Список литературы... 147 11 рнложение... 1 бо Введение СОКРАЩЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В ТЕКСТЕ ВЭН - вирус энтерита норок ГАЕ - гемагглютинирующая единица ГАА - гемагглютинирующий антиген Д - доза заражения ДСН - додеципсульфат натрия ЗС - защитная среда ИП - индекс пролиферации ИБП - иммунобиологический препарат МК - микоплазмы-контаминанты ММ - микробиологический метод Н - Норфлоксацин НД - нормативная документация П - Пефлоксацин ПЛК - перевиваемая линия клеток ВПЛК - вирус панлейкопении кошек ПК - первично-трипсивизированная культура клеток почки котенка ПС - питательная среда ПКГ - ирограмированная клеточная гибель ПЭС - парвовирусный энтерит собак ПАВ - поверхностно-активное вещество IIЦ - проточная цитометрия ПААГ - полиакриламидный гель ПЭГ - полиэтиленгликоль ПЦР - полимеразная цепная реакция РГА - реакция гемагглютинации РТГА - реакция торможения гемагглютинации СК - сыворотка крови ТВЕ - трис-боратный буфер УК - урожай клеток УФ - ультрафиолетовое излучение ФХЛ - фторхинолоны ФБР - фосфатно-буферный раствор ЦПД - цитопатогенное действие ЦХМ - цитохимический метод Э - Энрофлоксацин ЭК - Энрофлон-К ЭВМ - электронно вычеслительная машина ЭДТА - этилендиаминтетраацетат (динатриевая соль) SPB - денатурирующий буфер для загрузки белковых проб в ДСН-ПААГе STE - солевой трис-буфер 5 1. ВВЕДЕНИЕ Вирусный энтерит норок (ВЭН) - одно из наиболее распространенных острозаразных заболеваний пушных зверей. Экономический ущерб, наносимый звероводству ВЭН, складывается из гибели молодняка норок (до 90%), нарушения функции воспроизводства, а также значительных затрат на вете-ринарно-санитарные мероприятия. Существенное место в борьбе с ВЭН занимает специфическая профилактика (27,43, 4, 83, 37,49, 140, 138). За последние десятилетия ХХ-го века накоплен обширный материал по созданию противовирусных препаратов нового поколения: векторных, маркированных и синтетических. Однако, несмотря на значительные перспективы применения указанных видов вакцин, реальным на сегодняшний день остается профилактика ВЭН препаратами, изготовленными по традиционной технологии, с использованием первичных культур клеток почек котят (27, 32, 25, 44, 103, 102, 21, 177, 186, 199). Необходимо, однако, отметить, что применение данной культуральнои модели не перспективно по экономическим показателям, из-за сезонности получения доноров ткани, необходимости убоя котят, трудоемкости и длительности процесса трипсинизации ткани почек, опасности эндогенной контаминации суспензии клеток различными микроорганизмами и низкой производительностью метода стационарных мо-нослойных культур, а также невозможностью длительного пассирования вируса in vitro (89, 20, 178). Известно, что за последние 10-15 лет во всем мире резко возрос объем научных разработок, связанных с более широким применением перевиваемых линий клеток, в качестве субстрата, для производства противовирусных препаратов. Необходимо отметить, что используемые в практике линии клеток собак, кошек и норок характеризуются различной чувствительностью и не обеспечивают длительного поддержания ВЭН в пассажах (91, 80, 44, 102). Тем не менее, при общей тенденции более широкого применения МЛ К в биотехнологии, существует целый ряд нерешенных и малоизученных про- Г) блем, тормозящих процессы разработки и совершенствования противовирусных препаратов, и в частности, вакцин против ВЭН. Важное место в решении этих задач занимают вопросы: выбора, контроля и стабилизации свойств новых высокочувствительных к ВЭН культуральных моделей, совершенствования технологии и длительности культивирования ПЛК и штаммов ВЭН в больших объемах, создания рабочих и посевных банков клеток в жидком азоте, стабилизации свойств и условий хранения штаммов вируса, поиска и апробации новых более эффективных антибактериальных препаратов, а также проблем контаминации и деконтаминации культур и противовирусных препаратов от бактерий и микоплазм (21, 59, 17, 91, 92, 127, 190). Поэтому исследования, направленные на поиск, паспортизацию и стандартизацию ПЛК, предназначенные в качестве субстрата для получения ВЭН с выраженными антигенными свойствами представляют для науки и практики бесспорную актуальность. Цель и задачи исследований. Целью нашей работы являлась оптимизация условий культивирования вируса энтерита норок в культуре клеток и изучение его биологических свойств. Исходя из поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи: - провести сравнительное изучение чувствительности первичных и перевиваемых линий клеток к штаммам ВЭН и отобрать наиболее перспективные из них для серийного пассирования вируса; - деконтаминировать отобранные линии клеток от микоплазм и оптимизировать культивирование клеток и вируса в условиях стационарного и рол-лерного культивирования; - изучить физико-химические, антигенные и иммуногенные свойства куль-турапьного ВЭН различного уровня пассажей. - определить условия стабилизации и хранения культурального ВЭН; Научная новизна. Определена и охарактеризована наиболее чувстви- 7 тельная к ВЭН линия клеток FS и доказана ее пригодность для получения активного гемагглютинирующего антигена в течение 25 пассажей. Разработана рациональная схема деконтаминации ПЛК кошек от мико-нлазменной инфекции при помощи фторхинолонов. Оптимизировано культивирование клеток и вируса в условиях стационарного и роллерного культивирования. Впервые показана возможность и перспективность использования метода проточной цитометрии для изучения популяции линий клеток кошачьего происхождения, используемых в качестве субстрата для размножения вируса. Определены физико-химические показатели белков и ДНК вирионов, антигенные и иммуногенные свойства культурального ВЭН различного уровня пассажей. Практическая значимость. Предложена культуральная модель FS и оптимальные условия серийного пассирования ВЭН стационарным и роллер-ным методами. Создан криобанк из линии клеток FS, очищенной от микоплазм. Разработаны «Методические указания по поддержанию, хранению и контролю линии клеток FS», утвержденные директором ФГУ «ВГНКИ» от 02. 03. 2004 г. Предложены защитная среда оптимального состава, режимы лиофили-зации и хранения сухих форм культурального вируса энтерита норок. Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: заседаниях ученого совета ФГУ «ВГНКИ» в 2000-2004 гг.; международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». - г. Щелково, 2001 г.; методической научно-практической конференции «Проблемы восстановления и дальнейшего развития клеточного пушного звероводства и кролиководства», посвященной 70-летию ГНУ НИИПЗК им. В.А. Афанасьева, п. Родники Московской обл., 2002 г.; международной научно-практической конференции «Современные 8 проблемы природопользования, охотоведения и звероводства», посвященной 80-летию ВНИИОЗ. - г.Киров, 2002г.; международной научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных», посвященной 45-летию ФГУ ВНИИЗЖ. - г.Владимир, 2003 г.; международной научной конференции «Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине». - г.Москва, 2003 г. Основные положения диссертации, выносимые на защиту: - теоретическое и практическое обоснование выбора ПЛК селезенки кошки (FS) и почки кошки (CRFK) для серийного пассирования ВЭН; - практические предложения по очистке ПЛК кошек от микоплазменной контаминации при помощи фторхинолонов; - способ и условия культивирования ВЭН в лабораторных и промышленных условиях; - физико-химические свойства культурального ВЭН различных пассажей; - перспективность применения ВЭН различного уровня пассажей для производства иммунобиологических и диагностических препаратов; - условия стабилизации культурального ВЭН методом лиофильного высушивания. Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 175 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц, 15 рисунков. Список литературы включает 199 источников, из них 93 иностранных авторов. Особую благодарность выражаю научному руководителю профессору Груздеву К.Н., профессору Уласову В.И. и всем сотрудникам отдела вирусных препаратов ФГУ«ВГНКИ» за помощь работе, а также Б.В. Виолину, И.Л. Обухову, Ю.Г. Опарину, Т.А. Скотниковой, Н.Ю. Смысловой, А.П. Пономареву. 2. Обзор литературы 2.1. Энтерит норок (историческая справка). Вирусный энтерит (болезнь Форта Вилиам, инфекционный энтерит норок) - острая инфекционная болезнь норок, вызываемая ДНК-содержащим вирусом семейства Parvoviridae. Она проявляется воспалительно-некротическими поражениями слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, брыжеечных лимфатических узлов, селезенки, зобной железы и костного мозга (14, 4, 38, 119, 196). К вирусу восприимчивы норки всех возрастов, но чаще всего поражаются щенки в период отсадки от матерей и переходе на самостоятельное кормление (8, 168). Болезнь сопровождается высокой летальностью (до 90%) (90, 193, 133). Впервые, возбудитель болезни - вирус энтерита норок (ВЭН) был выделен и зарегистрирован в 1947 году в Канаде провинции Онтарио. В 1949 году болезнь наблюдал и описал F. Schofield (181). В последующие годы болезнь широко распространилась по северным штатам США, ас 1958 года уже регистрировалась на племенных фермах Европы (90, 196). В России первые случаи заболевания зверей с признаками вирусного энтерита были отмечены в 1965 году (78). В настоящее время болезнь регистрируется во всех регионах. 2.2. Физико-химические и биологические свойства вируса энтерита норок. 2.2.1. Морфология, структура и химический состав вируса. По размеру и морфологии ВЭН относится к одному из самых мелких ДНК-содержащих вирусов животных (127, 134). Вирусные частицы имеют относительно простую структуру и состоят из 4-х белков и линейной одно-цепочечной молекулы ДНК (123, 129). Вирионы парвовирусов представляют К) собой мелкие безоболочечные изометрические частицы кубической симметрии в диаметре 18-26 нм. В очищенных препаратах найдены также частицы вируса размером от 6 до 12 нм, функции и значение которых изучены не достаточно полно (185, 123). Капсид парвовирусов состоит из капсомеров диаметром 2-4 нм (31, 149, 160, 174). Поверхность вирионов гладкая, без углублений и выростов. Липидов и углеводов в составе вирионов не обнаружено. Плавучая плотность вирионов в хлориде цезия составляет 1,38 - 1,45 г/см3. Плавучая плотность пустых и незрелых вирионов равна соответственно 1,31; 1,46 -1,48 г/см3 (123).. В состав вирионов парвовирусов входит односпиральная линейная плюс-ДНК (примерно 5000 нуклеотидов). В популяции вирионов парвовирусов могут присутствовать нити разной полярности - либо плюс-ДНК, либо минус-ДНК, способные гибридизироваться in vitro с образованием двуспп-ральных молекул (129, 139). Геном парвовирусов имеет на З1 - конце вирионной цепи полиидром-ную последовательность длиной около 115 оснований (186). Этот участок ДНК может сворачиваться в шпилечную структуру (Y или Т) , которая поддерживается водородными связями между комплементарными последовательностями. Полиндромные 5'-концевые участки также могут образовывать шпильки, однако их последовательность совершенно не похожа на последовательность наЗ'-конце вуирионной цепи (109, 129). Синтез и сборка ДНК ВЭН происходит в клеточном ядре. Локализация процесса репликации протекает в тесной зависимости с клеткой - хозяином, либо вирусами-помощниками (195). Репликация парвовирусов подавляется ингибиторами синтеза клеточной ДНК и происходит только в делящихся клетках. Максимальная скорость синтеза вирусной ДНК всегда совпадает с S-фазой клеточного цикла. Репликативная форма вирусной ДНК вначале, по-видимому, подвергается полуконсервативной репликации, а затем происходит синтез вирусных белков. Комплементарная нить репликативной формы II при этом сохраняется (193). Модели репликации нуклеиновой кислоты сводятся к включению исходной вирусной нити ДНК в линейную двунитчатую репликативную форму после внедрения вируса в клетку. Вирусная ДИК встраивается в клеточный геном только в двуспиральной форме (8 1, 129). Белки парвовирусов составляют 63-81 % массы вариона. Зрелые вирионы энтерита норок образованы четырьмя капсидными белками VP1, VP2, VP3 и VP4 с молекулярными массами 77,5; 63,5, 61,0 и 54,0 кД соответственно. Белковый капсид окружает геномную одноцепочечную ДНК отрицательной полярности длиной 5094 нуклеотидных остатка, содержащий две неиерекры-вающие открытые рамки считывания (123, 155). Первая находится в 5'-концевой половине генома и кодирует неструктурный белок NS1, вторая - в З'-концевой половине генома кодирует структурные белки VP1, VP2, VP3 и VP4. Белок VP2 является основным структурным белком, ответственный за сборку ВЭН (приблизительно 60 копий) и занимает около 80% от суммарного количества белка (192). Белок VP3 формируется только в полных капсидах путем отщепления 15-20 аминокислот от белка VP2. Белки VP1 и VP3 важны для проявления инфекционной активности вируса (108). 2.2.2. Физико-химические свойства вируса. Парвовирусы являются наиболее стабильными среди всех известных в настоящее время вирусов млекопитающих. ВЭН хорошо переносит лиофили-зацию и в высушенном виде сохраняется при температуре от 4 до 20°С в течение 12-13 месяцев (39). Кроме того, ВЭН весьма хорошо переносит и низкие температуры (-40°С), где инфекционный титр сохраняется в течение 3-4 лет. Однократное замораживание (при минус 40°С) и размораживание при комнатной температуре не влияло на гемаглютинирующие свойства вируса. В тоже время, двукратное замораживание и размораживание при указанных температурных режимах приводило к снижению гемаглютинирующей активности антигена в два раза (26). 12 Термостабильность ВЭН в определенной степени зависит и от степени его адаптации к клеточной системе. Свежевыделенные штаммы более чувствительны к температурным воздействиям, адаптированные - более резистентны (19). Ультрафиолетовые лучи разрушают ВЭН. Время необходимое для полной инактивации вируса определяется расстоянием от источника облучения, интенсивностью потока лучей и характером вируссодержащего материала (149). Солнечные лучи также губительно действуют на вирус, однако процесс проходит довольно медленно. При нагревании до 37°С снижение титра вируса происходит в течение 2-х часов, а при 56 С - в течение 48 часов. Нагревание до 100°С в течение 5 минут приводит к полной потере гемаглюти-нирующей активности ВЭН (57, 196). Подобно другим парвовирусам, ВЭН устойчив к действию эфира, хлороформа, трипсина и стабилен при рН среды 3,0-9,0 (165, 168). При обработке вируссодержащего материала указанными веществами гемагглютинирующая активность антигена практически не снижалась (5). В тоже время ВЭН высоко чувствителен к воздействию растворов формальдегида и йодистого калия (165). Исследования R.H. Johnsona (148) показали, что ВЭН инактивируется в 0,2, 0,1 и 0,05%-ном растворах формальдегида в течение 24 часов, 2-х и 3-х суток соответственно. Устойчивость вирусов к химическим веществам различна и зависит от строения вириона и нуклеиновой кислоты. Безоболочечные вирусы более устойчивы к действию дезинфектантов, чем вирусы, обладающие оболочкой (70, 120). Исследования Н.Ф. Чертовича (101) по стабильности штамма «Родники» ВЭН к химическим веществам показали, что ВЭН устойчив к действию молочной, муравьиной и уксусной кислоты, а также к химическим веществам относящимся к группе фенолов - фенолу, лизолу, крезолу. Перекись водорода и кальцинированная сода оказывали слабое инактивирующее действие на 13 возбудитель энтерита норок. Наиболее активными дезинфицирующими веществами в отношении ВЭН являются едкий натр, формальдегид, глутаро-вый альдегид и хлорсодержащие препараты. 2.2.3. Очистка вируса. Традиционно для очистки парвовирусов из культурального клеточного супернатанта используют следующие методы: СаСЬ - преципитацию (128), полиэтиленгликолевую преципитацию (170), центрифугирование в изопик-ническом градиенте CsCl (128, 170, 176) и гемадсорбционную элюцию (122). Часто их применяют в комплексе. Метод изопекнического центрифугирования в градиенте сахарозы- хлористого цезия ранее был успешно применен P.S. Carman, R.C. Povey (123) для очистки парвовирусов энтерита норок, собак, панлейкопении кошек. Этот метод используется для фракционирования зрелых вирионов. В модификации, с предварительным концентрированием ПЭГ-6000, метод изопик-нического центрифугирования в растворах хлористого цезия применялся P.R. Paradiso и др. (173) для фракционирования зрелых вирионов парвовируса собак. Выбор плотности раствора CsCl для градиента обосновывается литературными данными по плавучей плотности зрелых инфекционных вирпомом 1Г)П, в частности, 1,42-1,43 г/см3 (123). Одним из наиболее распространенных методов очистки вирусов и вирус-пых антигенов является иммуноафинная хромотография (IAC). Для парвови-русов этот метод впервые использовали при выделении вируса алеутской болезни норок из зараженных тканей (156). Несколько позже был разработан метод очистки и концентрации энтерита собак (CPV-2) при помощи IAC, в котором использовали мышиные моноклональные антитела к гемагглютини-рующему белку CPV-2. При этом было показано, что более 99% балластных белков удаляется и извлекается 70-90% инфекционного CPV-2 (177). I'I 2.2.4. Антигенные свойства вируса. Известно, что изучение антигенных свойств вирусов имеет огромное значение для классификации и идентификации возбудителей болезней животных. ВЭН обладает набором различных антигенов, которые выявляются в реакции нейтрализации (РН) (146, 168); реакции диффузной преципитации в агаровом геле (РДП) (31, 19); реакции связывания комплемента (РСК) (153); реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (36); метод флуоресцирующих антител (МФА) (33, 89). При сравнительном изучении различных штаммов ВЭН была установлена их антигенная иммунологическая идентичность (150). Отличия штаммов обнаружены только по показателю патогенности (135). ВЭН находится в тесном антигенном и иммунологическом родстве с вирусом панлейкопении кошек (ПЛК) (138, 127). C.G. Wills (194) установил, что ВЭН имеет близкое родство с вирусом ПЛК, но они различаются между собой по антигенной структуре, гемагглютинирующим свойствам, кругу хозяев и строению генома. Однако, А.К. Кириллов (31. 32) и W.L. Myers с соавторами (163) доказали тесное антигенное сходство этих вирусов, но не их идентичность, так как при перекрестном заражении не вызывают заболевания и гибели других видов животных, хотя иммунитет у них при этом образуется. С помощью реакции нейтрализации, иммунофлуоресценции и по характеристике репликативных форм ДНК показано антигенное родство ВЭН с возбудителем парвовирусного энтерита собак (ПЭС) (114, 166, 167). Однако, эти вирусы отличаются по спектру гемагглютинации с различными эритроцитами животных, тропизму к клеткам хозяина in vitro и уровнем патогенности (167). В 1983 году Е.Ю.Зеленов (25) изучал антигенные свойства ВЭН штамма «Ладожский» в перекрестной РТГА с использованием сывороток против ВЭН, ПЭС, ПЛК и парвовирусной инфекции свиней (ПИС). В качестве ант- 15 гена в реакции использовал нативный вирус, выделенный из фекалий больных норок и культуральныи вирус первого пассажа в культуре почки котенка (ПК). Было доказано, что ВЭН имеет антигенное родство с ПЭС и ПЛК, а с возбудителем ПИС антигенного родства не установлено. Ряд исследователей, изучая первичные структуры вирусов ПЛК, ПЭС и ВЭН установили, что они содержат более 98% подобия в последовательности оснований внутри капсида. Наиболее идентичными были ПЛК и ВЭ11, кои>-рые отличаются только по восьми сайтам рестрикции, а ПЭС и ВЭН различаются менее чем на 1% по нуклеотидной последовательности ДНК, но поражают разных хозяев. Кроме того, между ПЛК, ПЭС и ВЭН отсутствуют физико-химические различия и в тоже время они отличаются по чувствительности к ним клеточных культур и по гемагглютинирующей активности. Заражение первичных и перевиваемых культур клеток кошек и собак показало, что вирусы ПЛК и ВЭН размножаются только в клеточных культурах тканей кошек, а ПЭС - в культурах клеток собак и кошек (107, 171). Изучению гемагглютинирующих свойств ВЭН посвящено незначительное количество работ (89, 36, 57> 125, 168), авторы которых считают, что степень агглютинирующей активности парвовирусов связана с капсидом и зависит от типа эритроцитов, штамма вируса, температуры, рН и ионного состава среды. В настоящее время известно, что молекулярными структурами, ответственными за гемагглютинирующую активность ВЭН являются белки VP1 и VP3, экспонированные на поверхности вирусной частицы (108). Явление гемагглютинации представляет собой взаимодействие между молекулами, которые очень сходны по своему составу и структуре, но резко отличаются по своим зарядовым свойствам. Как и вирусные белки, ответственные за гемагглютинацию, так и рецепторы эритроцитов являются низкомолекулярными гликопротеидами, склонными к агрегации после их изоляции. В нативном виде гликопротеиды имеют специфические места, чувстви- 16 тельные к трипсину, гидрофобную часть в области карбоксильного конца молекулы и гидрофильную область у N-конца. Различия между ними состоят в содержании в них остатков сиаловой кислоты. В то время как для глико-протеида эритроцитов содержание сиаловой кислоты составляет 27%, а в гликопротеидах вируса сиаловая кислота отсутствует. Поскольку, при физиологических значениях рН карбоксильная группа сиаловой кислоты находится в ионизированном состоянии, где ионное окружение эритроцита должно значительно отличаться от ионного окружения вируса. Присутствие сиа-ловых кислот на поверхности эритроцитов, по-видимому, является необходимым условием адсорбции на них ВЭН, поскольку полное удаление их приводит к тому, что эритроциты становятся не способными к агглютинации (158). Для всех вирусных штаммов наблюдаемая степень агглютинации зависит от двух противоположных реакций - адсорбции и элюции, поскольку для адсорбции необходимы столкновения между эритроцитами и вирусными частицами, где скорость реакции определяется концентрацией реагентов и почти не зависит от температуры. Элюция представляет результат ферментной деструкции и поэтому является температурозависимым процессом. Так, в исследованиях Е.Ю. Зеленова (25) показано влияние температуры (37, 20 и 4°С) на гемагглютинирующие свойства ВЭН. В результате опыта агглютинация эритроцитов происходила только при 4°С, при 20 С — происходила спонтанная агглютинация эритроцитов, а при 37°С эритроциты оседали на дно лунки в виде «пуговки» без промежуточной агглютинации. Изучая антигенные свойства ВЭН, R.H. Johnson (146) также наблюдал агглютинацию свинных эритроцитов при 4°С, которая характеризовалась спонтанной элюцией при комнатной температуре и затем вновь воспроизводилась на холоде. При обработке оптимальных условий постановки РГА в различных условиях Л.Л. Сулимовым с соавторами (89) были изучены гемагглютинирующие 17 свойства ВЭН с эритроцитами 10 видов животных. Исследования показали, что эффективно вирус агглютинирует эритроциты свиньи и зеленой мартышки, хуже - эритроциты барана, коровы, курицы, норки и совсем не агглютинирует эритроциты кролика, хомяка и морской свинки. Более выраженная агглютинация эритроцитов происходила при рН 6,4-6,8 и использовании ?а-буференного физиологического раствора (ЗБФ). Е.Ю. Зеленое (57) подтвердили эти результаты и дополнили их данными по изучению гемагглютинирующих свойств вируса с эритроцитами от других видов животных (песца, лисицы, соболя, кошки, мыши и крысы белых). Наилучшая агглютинация эритроцитов наблюдалась при рН 6,6 ЗБФ. Максимальные значения титров ВЭН отмечали с эритроцитами свиньи (1:16 384 ГАЕ) и кошки (1:512 ГАЕ). Было также показано, что обработка вируса эфиром, хлороформом и трипсином не влияла на его гемагглютинирующие свойства. Данные литературы свидетельствуют о том, что ВЭН обладает выраженной антигенной активностью и индуцирует у животных синтез нейтрализующих и антигемагглютинирующих антител. Одними из самых важных поверхностных антигенов являются белки, стимулирующие синтез антител, нейтрализующих инфекционность и ингибирующих гемагглютинацию. Исходя из приведенных выше данных, представляло интерес изучить гемагглютинирующие свойства культурального ВЭН высоких уровней пассажа, так как по данным многочисленных исследователей полученный антиген по сравнению с тканевым, чище и активнее, а также имеет существенные преимущества для изготовления инактивированной вакцины против ВЭН. Таким образом, исследования по изучению физико-химических и биологических свойств возбудителя легли в основу разработок новых способов и методов получения культурального антигена ВЭН.

Список литературы

Цена, в рублях: (при оплате в другой валюте, пересчет по курсу центрального банка на день оплаты)	1425

Скачать бесплатно	24243.doc

Найти готовую работу

ЗАКАЗАТЬ

Обратная связь:

Связаться

Вход для партнеров

Регистрация

Восстановить доступ

Материал для курсовых и дипломных работ

29.04.24 Результаты оценки психологических детерминант гражданской идентичности учащихся старших классов

29.04.24 Программа формирования гражданской идентичности старшеклассников

29.04.24 Психологические основания для разработки программы формирования гражданской идентичности старшеклассников

Архив материала для курсовых и дипломных работ

Ссылки:

Счетчики:

Быстрый переход к готовым работам

Мнение посетителей:

Найти готовую работу

Обратная связь:

Вход для партнеров

© 2006-2022. Все права защищены. Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.

© 2006-2022. Все права защищены.
Выполнение уникальных качественных работ - от эссе и реферата до диссертации. Заказ готовых, сдававшихся ранее работ.